Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Российский государственный медицинский университет

 Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

 

 

 

 

 

 

Реферат

 

«Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Самойликов Павел Владимирович

интерн кафедры «Клинической лабораторной диагностики»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2009 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

 

 

 

Введение. 3

Иммуноферментный анализ. 3

Классификация ИФА. 5

Характеристика компонентов, используемых в ИФА. 6

Варианты постановки ИФА. 11

Общий принцип. 11 

Непрямой ИФА.. 13 

«Сэндвич» –  вариант ИФА для выявления антигенов. 14 

Конкурентный ИФА. 16 

Ингибиторный ИФА. 16 

Метод иммуноферментных пятен (ELISPOT). 18 

Системы усиления сигнала. 19

Практическое применение ИФА. 21

Список используемой литературы. 23

 

Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике.

 

Введение. 

 

Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты  иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами.

Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы.

В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

В данной работе будет рассмотрен только иммуноферментный анализ – метод широко распространенный в биологии и медицине, как практической, так и фундаментальной.

Иммуноферментный анализ. 

 

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

 

Рисунок 1. Основной принцып ИФА.

1) Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител.

 

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана  простой схемой:

[AT]+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

            Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

 

Классификация ИФА. 

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

            А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

            Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

Характеристика компонентов, используемых в ИФА. 

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

–  возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

 

Таблица 1.

Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.

 

Фрмент	Источник получения	М.М. (кДа)	Субстрат (рекомендуемая длина волны при фотометрии, нм)	Конъюгирующий реагент
Пероксидаза хрена	Хрен (Armoracia rusticana)	40	О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД, 492 нм) 5-аминосалициловая кислота      (450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин.	Глутаральдегид Мета-периодат натрия N-сукцинимидил-3 (2-пиридилдитио) пропионат
β-D-галак-тозидаза	E. Coli	540	О-нитрофенил-β-D-галактозид (420 нм)	Мета-малеимидобензол-N-гидроксисукцинимидный эфир
Щелочная фосфотаза	E. Coli, слизистая кишечника теленка	84-150	Р-нитрофенилфосфат (405 нм), 5-Бром-4-хлоро-3-индолил фосфат	Глутаральдегид

 

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образу­ют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Антигены и антитела.

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувст­вительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности ис­пользуемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или монокли­нальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чув­ствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах.

Образование конъюгата

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Обра­зование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введе­ния ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою био­логическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстра­том, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позво­ляет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойст­вам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антиге­на с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками про­изводится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляет­ся иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы при­готовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом дос­тупных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реа­гентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свобод­ного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фер­мента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фер­мента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 мо­лекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую фер­ментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких обра­зовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

- высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, умень­шить неспецифическое связывание;

-  достаточной специфичностью в рабочем разведении;

- преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные фор­мы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

- оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

- достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство опреде­ляется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различ­ные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещест­ва. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планше­ты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорб­ция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсор­бируемого вещества. Адсорбционная поверхность мембран различного типа (нитроцеллюлоза, нейлон и др.) в 100-1000 раз выше, чем у пластика.

Полисахариды и сильногликозилированные белки часто имеют низкую аффинность для полистирола. Необходимы другие методы для их иммобилиза­ции, например, ковалентное присоединение с помощью глутарового альдегида. Ковалентное присоединение эффективно, если в качестве твердой фазы исполь­зуются гидрофильные бусы (агароза) и полистироловые бусы.

Иммунохимические методы основываются на использовании предвари­тельно адсорбированных «ловушечных» антител для иммобилизации антигена или антител. Антиген, иммобилизованный иммунохимически, в 10 раз активнее, чем пассивно адсорбированный антиген. Могут использоваться лектины или иммуноглобулин-связывающие белки бактерий, которые легко адсорбируются на пластике или других гидрофобных поверхностях , например конканавалин А (Кон А) или стаффилококковый белок А. Кон А способен иммобилизовать gp 120 - белок вируса ВИЧ.

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорби­руемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвраще­ния неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу ос­новного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты - бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Варианты постановки ИФА. 

Общий принцип. 

В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмывани­ем.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лун­ках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверх­ности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся ком­поненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и свя­зывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фер­мента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Важный этап любого варианта твердофазного анализа – процедура отмыв­ки от несвязавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из всей глубины слоя. Это наибо­лее длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может произ­водиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора – вошера или вручную, многоканальной пипеткой. Для проведения ИФА необходимы:

– полистироловый планшет или другие использующиеся варианты твердой фазы;

– отмывающий раствор;

– конъюгат (меченные ферментной меткой антигены или антитела);

– смесь используемых субстратов;

– останавливающий раствор (Стоп-реагент – раствор для останавливания ре­акции);

– образцы, использующиеся для положительного и/или отрицательного кон­троля;

– стандартный антиген (для построения калибровочной кривой);

– одно- и многоканальные пипетки;

– вошер (промыватель);

– оптический прибор для определения оптической плотности исследуемого раствора (ИФА-ридер, считыватель, который последовательно фотометрирует все лунки);

– 5-100 мкл исследуемого биологическою материала.

Прямой ИФА

1. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый ма­териал). Выше отмечалось, что антигены существенно различаются по способ­ности адсорбироваться на разных видах пластика в зависимости от того, к како­му классу веществ (белкам, углеводам или липопротеинам) они принадлежат. Часто в прямом ИФА антиген, иммобилизованный на твердой фазе, это клетки и другие корпускулярные антигены.

Контроль. В качестве контроля используют лунки с адсорбированным положи­тельным контрольным образцом, в котором обязательно содержится искомый антиген, и отрицательным контрольным образцом заведомо не содержащим ис­следуемого антигена. При наличии очищенного стандартного антигена реакцию проводят в нескольких разведениях, так чтобы можно было построить калибро­вочную кривую.

2. «Блокируют свободные места связывания, оставшиеся на твердой фазе, с помощью БСА казеина и др. (для предотвращения неспецифической сорбции конъюгата на твердой фазе).

3. В лунки вносят меченные ферментом антитела или антигены (конъюгат), инкубируют. Связывание конъюгата с твердой фазой будет происходить лишь в случае комплементарности обоих компонентов системы. После  инкубации с коньюгатом лунки отмывают, удаляя, таким образом, не связавшуюся часть конъюгата.

4. Затем в лунки вносят субстрат, специфичный для используемого фермента, и инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем, ферментативную реакцию останавливают.

5. Учет реакции. Сначала результаты реакции учитывают визуально. Для бо­лее точного учета результатов интенсивность окрашивания оценивают на ИФА-ридере с соответствующим светофильтром. По результатам проведенного анализа строят график зависимости оптической плотносги от концетрации (рис. 2).

 

 

 

 

Рисунок 2. Прямой ИФА.

а) для выявления антигена; б) для выявления антител.

 

 

Непрямой ИФА 

Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата. В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах. Реакция методически проста.

Основные этапы непрямого ИФА для определения антител:

1. Антиген адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от несвязавшихся компонентов.

2. Блокируют свободные месга связывания. Отмывают.

3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят проце­дуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.

4. Добавляют антиглобулиновый конъюгат в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от несвязавшихся компонентов.

5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окраши­вания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.

6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере (рис.3).

При оптимальных условиях проведения анализа метод высокоспецифичен и чувствителен. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антител в сы­воротках исследуемых больных. Для получения удовлетворительных результа­тов необходима стандартизация реагентов и методических приемов. Этот вари­ант ИФА может также использоваться для тестирования моноклональных антител.

«Сэндвич» –  вариант ИФА для выявления антигенов. 

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повто­ряющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфич­ности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с иссле­дуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные фер­ментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все осталь­ные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Основные этапы анализа:

1. На твердой фазе иммобилизуют моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела.

2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положи­тельный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различ­ных разведениях.  Инкубируют и отмывают.

3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела – конъюгат. После инкубации проводят отмывку.

4. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении опти­мального окрашивания в лунках с положительным контролем.

5. Учет результатов на ИФА-ридере.

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, пре­восходящая возможности других схем ИФА (рис.4).

 

 

Рисунок 3. Непрямой ИФА для выявления антител.

 

 

Конкурентный ИФА. 

Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и неме­ченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для оп­ределения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый ан­тиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антите­лами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы.

Конкурентный метод требует минимального числа операций, незначительно­го расхода реагентов и легко может бытъ автоматизирован. При проведении конкурентного ИФА для выявления антител лучше использовать меченые мо­ноклинальные антитела, тогда конкуренция конъюгата с исследуемым образцом происходит за единственный эпитоп адсорбированного на твердой фазе антиге­на. Этот вариант ИФА применяется для определения различных соединений, таких как иммуноглобулины человека, раково-эмбриональный антиген, инсулин и др. Он позволяет выявлять антитела к диагностически значимым эпитопам инфекционных агентов.

Основные этапы анализа для выявления антигена (рис.5):

1. На твердой фазе иммобилизуют специфические для выявляемого антигена моноклональные антитела.

2. В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный фер­ментом, и исследуемый образец. Проводят инкубацию и отмывку. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для по­строения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях.

3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

4. Учет реакции на ИФА-ридере.

В этом случае количество антигена в исследуемом образце обратно пропор­ционально ферментативной активности на твердой фазе.

Ингибиторный ИФА.

В этом варианте ИФА антиген, присутствующий в исследуемом образце, свя­зывается с моноклональными антителами, меченными ферментной меткой, и ингибирует их взаимодействие со стандартным антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Присутствие в образце даже следовых количеств специфичного к конъюгату антигена будет ингибировать связывание меченых антител с иммобилизованным антигеном. Степень ингибирования прямо пропорциональ­на содержанию антигена в растворе. Для проведения количественного анализа строят кали6ровочную кривую с помощью последовательных разведений стан­дартного антигена. Основные этапы ингибиторного ИФА для выявления антигена (рис.6).

1. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген. Подбирают рабочее разведение меченых антител с помощью титрования.

 

 

Рисунок 4. «Сэндвич»- вариант ИФА.

 

 

Рисунок 5. Конкурентный ИФА                      Рисунок 6. Ингибиторный ИФА

 

2. Проводят предварительную инкубацию конъюгата в разведении, предшест­вующем рабочему, с разведениями исследуемого образца, стандартного анти­гена и положительных контрольных проб.

3. Смесь переносят в лунки панелей. Для контроля 100%-ного связывания в несколько лунок вносят только меченые антитела, без ингибирующего антигена. Панели инкубируют, затем проводят отмывку.

4. Добавляют субстрат.

5.  Проводят учет результатов.

Концентрация определяемого антигена в исследуемом образце обратно пропорциональна ферментативной активности на твердой фазе.

ИФА может использоваться не только для определения растворимого анти­гена или антитела, но и клеток, вырабатывающих различные белки.

Метод иммуноферментных пятен (ELISPOT). 

В 1983 году адаптировали технологию твердофазного ИФА для определения лимфоидных клеток, секретирующих антитела или антигены (например, цитокины),    in    vitro.    Метод    получил    название    ELISPOT    (метод иммуноферментных зон или пятен). Основной принцип метода:

1. На поверхности полистироловой лунки (используют 24-х луночные панели для культивирования клеток) сорбируют антигены или антитела, которые слу­жат «ловушечными» реагентами.

2. Добавляют исследуемые лимфоидные клетки, культивируют несколько часов при 37°С, давая им возможность занять определенное место и выполнить секреторную функцию. Антитела или антигены, секретируемые такими клетками, улавливаются адсорбированными на твердой фазе реагентами.

3. Клетки удаляют, используя для этого отмывающий раствор с детергентом, лизирующим клетки.

4. Участки накопления секреторных продуктов проявляют, добавляя связанные с ферментом антитела (антиглобулиновый реагент).

5. Добавляют смесь субстрата с агарозой (используемые субстраты должны растворяться в агарозе и образовывать нерастворимые продукты реакции), на поверхности твердой фазы образуются коричневые или голубые пятна (в зави­симости от используемых ферментов и субстратов), выявляя участки, где распо­лагались клетки.

• Образовавшиеся пятна подсчитывают под микроскопом, это и будет количе­ство секретирующих клеток.

В качестве твердой фазы может быть использована нитроцеллюлозная мем­брана В этом случае есть ряд преимуществ: из-за высокой адсорбционной спо­собности НЦМ требуется значительно меньшее количество антигена, исполь­зуемого в качестве «ловушечного» реагента, кроме того, отпадает необходи­мость во включении агарозы в субстрат.

При параллельном определении количества секретирующих клеток и общего количества секретируемого антигена или антитела в лунке, что возможно при использовании другого субстрата, можно выявить количество секретируемого вещества единичной клеткой.

Данный метод нашел широкое применение для оценки количества клеток, секретирующих антиген, улавливаемый адсорбированными антителами, ис­пользуется для определения количества клеток, секретирующих цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а).

 

Системы усиления сигнала. 

При использовании высокоаффинных антител чувствительность отдельных вариантов ИФА очень высока и теоретически позволяет выявить единичные молекулы антигена, но на практике чувствительность ограничивается рядом факторов: активностью фермента, интенсивностью сигнала и методами учета сигнала. Системы усиления сигнала дают возможность повышать чувствитель­ность различных вариантов ИФА. Рассмотрим некоторые такие системы:

На основе взаимодействия авидин-биотин.

Молекулы кофермента биотина (м.м. 244 Да) конъюгируют с антителами при помощи биотинил-N-гидроксисукцимида. Небольших размеров молекулу био­тина проще присоединить к иммуноглобулину или другому белку без наруше­ния его иммунных или ферментативных свойств. Фермент в этом случае связы­вают с гликопротеином яичного белка авидином. Аффинносгь связывания авидина с биотином очень высока (константа диссоциации комплекса – 10^-15 моль), конъюгат авидин-фермент прочно фиксируется на комплексе антиген-антитело-биотин. После добавления соответствующего субстрата проводят определение продукта реакции спектрофотометрически или по интенсивности люминесцен­ции.

Одна молекула авидина состоит из четырех идентичных субъединиц, спо­собна взаимодействовать с четырьмя молекулами биотина, что позволяет ис­пользовать его как связующую молекулу между двумя биотинсодержащими со­единениями. В этом случае фермент тоже биотинилируют, а авидин выполняет функцию мостика, соединяя две молекулы, содержащие остатки биотина. К об­разовавшемуся комплексу антиген-антитело-биотин добавляют свободный ави­дин, а затем биотинилированный фермент. Проводят учет реакции.

Белок авидин может неспецифически сорбироваться на других молекулах, поэтому все чаще используют другой биотинсвязывающий белок - стрептавидин, обнаруженный в бактериях Streptomyces avidinii. Стрептавидин также об­разует прочный комплекс с биотином и состоит из четырех идентичных субъе­диниц.

Применение авидин-биотинового комплекса позволяет значительно повы­сить чувствительность ИФА, так как при синтезе конъюгата с одной молекулой АТ можно связать десятки молекул биотина. Получение конъюгатов (антител и ферментов с биотином) осуществляется  достаточно легко и сопровождается минимальными изменениями их иммунологической и ферментативной активно­сти. Конъюгаты ферментов с биотином могут быть использованы как универ­сальные реагенты.

Использование хемилюминесцентных реакций.

Хемилюминесцентные реакции можно использовать для получения сигнала в ИФА, при этом повышается чувствительность метода и сокращается время проведения анализа. В качестве метки в ИФА широко применяют пероксидазу хрена, для ее выявления можно использовать и различные хемилюминесцентные реакции. Хемилюминесцентные реакции основаны на способности люминола светиться при окислении перекисью водорода. В прямом анализе при ферментативной реакции образуется перекись водорода и окисляет люминол, катализатором этой реакции выступает пероксидаза хрена. Для усиления сигнала используются различные соединения, например, люциферин, фенолы, в этом случае интенсивность люминесценции усиливается в 10-100 раз, в отдельных вариантах в 500 раз (усиленный хемилюминесцентный анализ). Люминесцентный сигнал очень стабилен, его уровень достигает максимума за 30 с (для сравнения: цветная реакция с ОФД в качестве индикатора полностью развивается лишь за 30 мин).

При непрямом анализе люминолом или его производными метится антитело. Такая метка в свободном состоянии способна окисляться перекисью водорода с выделением света. Если она образовала комплекс, то теряет способность окисляться.

На основе каскадных систем.

Для повышения чувствительности ИФА можно использовать  ферментные каскадные системы. В этом случае первый фермент, связанный с антителами, приводит к образованию восстанавливаемого субстрата для второй ферментной системы. Вторая ферментная система может быть субстрат-циклической или редоксициклической. Ферментными метками в этом случае могут служить фосфо-глюкоизомераза, альдолаза, щелочная фосфатаза. Конечный продукт реак­ции определяют визуально или спектрофотометрически.

Системы амплификации в ИФА позволяют добиться высокой чувствительно­сти. Такие ИФА-системы используются для определения уровня гормонов (ти-реостимулирующего, прогестерона и др.).

Практическое применение ИФА. 

ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биоло­гии благодаря относительной простоте и высокой чувствительности метода. ИФА успешно применяется для:

• массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним);

• выявления и определения уровня гормонов и лекарственных пре­паратов в биологических образцах;

• определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;

• выявления иммунных комплексов;

• выявления онкомаркеров;

• определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.);

• определения общего IgE и специфических IgE антител;

• скрининга моиоклональных антител;

• определения цитокинов в биологических жидкостях.

Чувствительность метода

ИФА пришел на смену широко используемым ранее в клинической практике методам агглютинации, преципитации и РИА. По сравнению с вышеназванными методами ИФА менее трудоемок и менее продолжителен по времени, удобен для выполнения большого числа однотипных анализов.

В ИФА сочетается уникальная специфичность иммунохимического анализа с высокой чувствительностью определения ферментной метки. Чувствительность метода (под чувствительностью подразумевают минимальное выявляемое количество антител или антигена) определяется следующими факторами: аффинностью антител, предпочтительнее использование моноклональных антител; специфической активностью фермента; интенсивностью сигнала; чувствительностью учета сигнала. Различные варианты ИФА различаются по своей чувствительности. Отдельные варианты твердофазного ИФА позволяют выявлять в образце единичные молекулы. Средняя чувствительность ИФА – 10^-9 – 10^-12 моль.

Список используемой литературы. 

 

1. Галактионов В.Г. Иммунология. Издательство Московского университета, 1998 г.
2. Кишкун А.А. Иммунологические исследования и методы диагностики инфекционных заболеваний в клинической практике. Медицинское информационное агентство, 2009 г.
3. Кондратьева И.А. Практикум по иммунологии. Учебное пособие для ВУЗов. Академия, 2004 г.
4. Лефковитс И., Пернис Б. Иммунологические методы исследования. Мир, 1988 г.
5. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Мир, 2000 г.
6. Соколов Е.И. Клиническая иммунология. Медицина, 1998 г.
7. Фримель Г. Иммунологические методы. Медицина, 1987 г.
8. Хаитов Р. М. Иммунология. Медицина, 2000 г.
9. Шигина Ю.В. Иммунология: Учебное пособие. Издательство РИОР, 2007 г.
10. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Медицина, 1999 г.

 

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Реферат «Принципы иммуноферментного анал

 

• 14:21 05 Июля 2016
  Российско-китайский медуниверситет откроет магистерскую программу по TCM
• 01:21 05 Июля 2016
  На форуме МГУ Россия и Китай обсудят научно-образовательное сотрудничество
• 11:00 04 Июля 2016
  Реморенко: "ЕГЭ-туризм" в России сходит на нет
• 10:52 04 Июля 2016
  Летняя российско-австрийская школа откроется в Москве
• 15:31 01 Июля 2016
  В СПбГУ могут воссоздать географический факультет

Заказать уникальную работу