Ѕаза знаний студента. –еферат, курсова€, контрольна€, диплом на заказ

курсовые,контрольные,дипломы,рефераты

»сследование клеточного цикла методом проточной цитометрии — Ѕиологи€

ѕосмотреть видео по теме  урсовой

Ѕ≈Ћќ–”—— »…†† √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌџ…†† ”Ќ»¬≈–—»“≈“

Ѕиологический факультет

кафедра генетики и биотехнологии

»——Ћ≈ƒќ¬јЌ»≈†  Ћ≈“ќ„Ќќ√ќ† ÷» Ћј† ћ≈“ќƒќћ ѕ–ќ“ќ„Ќќ…† ÷»“ќћ≈“–»»

†††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††  урсова€ работа

††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††† студентки 3 курса Ў”“ ћ.¬.

††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††† Ќаучный руководитель:

††††††††††††††††††††††††††††††

†††††††††††††††††††† †††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††канд. биол. наук,

††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††† доцент √Ћ”Ў≈Ќ —. ¬.

ћинск† 2001г.

ќ√Ћј¬Ћ≈Ќ»≈

¬¬≈ƒ≈Ќ»≈ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ..3

ќЅ«ќ– Ћ»“≈–ј“”–џЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ4

††

††††††††††††† 1.ќбщие принципы проточной цитометрии ЕЕЕЕЕЕЕЕ..4

†††††††††††††

††††††††††††† 2. јнализ ƒЌ -гистограмм ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ.5

†††††††††††††

††††††††††††† 3. јнализ параметров клеточного циклаЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ.9†††††††

††††††††††††

††††† ††††††††4.Ќаиболее употребительные методики,† используемые

†††††††††††††††† в цитометрии клеточного циклаЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ..14

†††††††††††††

††††††††††††† 5.ѕрименение цитометрии в молекул€рной

††††††††††††††† клинической диагностикеЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ..17

«ј Ћё„≈Ќ»≈ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ..22


Ћ»“≈–ј“”–јЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ..23

††††† ¬¬≈ƒ≈Ќ»≈

†††††††† ¬озможности применени€ методов количественной цитометрии в биологических и медицинских исследовани€х очень широки. ќни включают множество задач, начина€ от поиска наиболее информативных морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики ƒЌ  в клеточном цикле и конча€ многопараметрическим изучением гетерогенных попул€ций исследуемых объектов. ’от€ эти задачи могут решатьс€ на различных экспериментальных модел€х или клиническом материале, общие принципы остаютс€ одинаковыми как дл€ тех, так и других объектов.

††††††††† ¬ насто€щее врем€ цитометрию прин€то подраздел€ть на проточную и статическую. ѕервый вариант цитометрии осуществл€етс€ с помощью специальных приборов Ц проточных цитометров и сортеров. ƒл€ статической цитометрии могут быть использованы конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах. —уществует много методик, которые с одинаковым успехом† можно воспроизводить† как с помощью проточной, так и статической цитометрии. Ѕолее того, статическа€ цитометри€ в некоторых случа€х позвол€ет получить более обширную информацию о клетках, причем ее производительность не намного меньше проточной.

††††††††† Ќасто€щий обзор литературы посв€щен применению цитометрии дл€ оценки параметров клеточного цикла на экспериментальном и клиническом материале. ’от€ в обзоре в основном привод€тс€ сведени€, касающиес€ проточной цитометрии, с учетом изложенного выше они в значительной степени распростран€ютс€ также и на статическую цитометрию.†

†††††††

††††††† ќЅ«ќ–† Ћ»“≈–ј“”–џ

†1.ќбщие принципы проточной цитометрии

ћетод проточной цитометрии сформировалс€ за последние 30 лет на основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их размеров. ¬ 1965 г. по€вилось первое сообщение о клеточном сортере, а в 70-х годах стали выпускать приборы, способные измер€ть интенсивность флуоресценции при двух и более длинах волн и определ€ть сразу несколько клеточных параметров.

†¬ насто€щее врем€ выпускают два основных типа приборов дл€ проточной цитометрии: 1) простые в использовании аппараты, которые могут измер€ть флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассе€ние под углом около 10º (малоугловое пр€мое рассе€ние) и 90º; 2) большие клеточные сортеры, которые не только измер€ют п€ть и более клеточных или €дерных параметров, но и сортируют частицы с заданным набором этих параметров.

ѕринципы проточной цитометрии весьма просты.  летки или €дра поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. —вет определенной длины возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, св€занных с различными клеточными компонентами, при этом† при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позвол€ет оценить сразу несколько клеточных параметров. —вет, испускаемый красител€ми, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. —ветовые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную дл€ компьютерной обработки и хранени€ информации.

ћетодом проточной цитометрии можно получать самые разные данные: определ€ть содержание в клетке ƒЌ  и –Ќ , суммарное количество белков и количество специфических белков, узнаваемых моноклональными антителами, исследовать клеточный метаболизм (например, измер€ть внутриклеточный рЌ), изучать транспорт ионов кальци€ и кинетику ферментативных реакций (M.G.Ormerod, 1990).

¬ продаже имеютс€ разные проточные цитометры, и изложить общие принципы их работы сложно. ћожно отметить лишь несколько моментов, общих дл€ всех приборов:

Ц          ;

Ц          ;

Ц          дл€ устранени€ эффектов, св€занных с возможной агрегацией клеток, необходимо использовать всю доступную информацию, например данные по рассе€нию света в объеме и отношение площади пика к его ширине.

2. јнализ ƒЌ -гистограмм

»змерение содержани€ ƒЌ  Ц одно из самых простых и распространенных применений проточной цитометрии. ѕервые ƒЌ -гистограммы, полученные в 1969 г.(M.A.Van Dilla, T.T. Trujillo, P.F.Mullaney, J.R.Coulter, 1969), позволили четко различить клетки, наход€щиес€ в G1-, S- и G2/ћ-фазах клеточного цикла. — тех пор по€вилось множество работ по измерению содержани€ ƒЌ  в клиническом материале, полученном в основном от больных раком.

»з ƒЌ -гистограмм можно получить два рода данных. ¬о-первых, идентифицировать клетки с аномальным содержанием ƒЌ  (рис.1, Ѕ), так называемые анеуплоидные клетки. ¬о-вторых, определить долю клеток, наход€щихс€ в S-фазе (SPF), и оценить степень пролиферации.  ак правило, в клеточной попул€ции с высокой пролиферативной активностью число клеток в S-фазе больше, чем обычно.

†ћеждународный комитет по аналитической цитометрии (W.Hoddeman, J.Schumann, M.Andreeff, B.Barlogie, C.J.Herman, R.C.Lief et.al, 1984) попыталс€ стандартизировать множество способов анализа ƒЌ -гистограмм, и тем не менее дл€ анализа продолжают использовать различные подходы, часто с привлечением компьютерных прграмм. ƒалее будут рассмотрены некоторые из этих подходов :

 

† ¬ычисление коэффициента вариации (CV)

—амый простой способ оценки качества результатов основан на вычислении CV дл€ G1-пика ƒЌ  диплоидных клеток. Ёта величина определ€етс€ из приведенного ниже соотношени€ в предположении, что G1-пик следует нормальному распределению:

CV = W / (M Ј 2,35),

√де W Ц ширина пика на уровне полувысоты, ћ Ц номер канала дл€ максимума G1- пика.

„ем меньше CV и чем лучше G1-пик отвечает нормальному распределению, тем качественнее результаты. ¬ действительности качество ƒЌ -гистограмм, как правило, не очень высоко, и чтобы судить о достоверности результатов, полученных при клинических исследовани€х, приходитс€ оценивать средний CV и диапазон его значений.

¬ычисление индекса ƒЌ 

»ндекс ƒЌ  дл€ Ђанеуплоидногої пика (пиков) на гистограммах с двум€ или более G1-пиками (рис.1, Ѕ) вычисл€ют, ориентиру€сь на Ђдиплоидныйї G1-пик. “ак, на рис. 1, Ѕ G1-пику дл€ опухолевых клеток соответствует вдвое большее количество ƒЌ , чем G1-пику диплоидных клеток, поэтому индекс ƒЌ  дл€ него равен 2,0. ƒл€ анеуплоидных клеток, содержащих на 50% больше ƒЌ , чем нормальные, индекс равен 1,5. јнеуплоидию можно вы€вить только в тех случа€х, когда на гистограммах имеетс€ не менее двух G1-пиков. „тобы установить, какой из близко расположенных друг к другу G1-пиков соответствует диплоидным клеткам из свежих образцов ткани, можно использовать внешний ƒЌ -стандарт. ≈сли присутствуют только диплоидные клетки, то »ƒ считают равным 1,0.

ќсновна€ проблема при определении плоидности св€зана с трудностью вы€влени€ малого числа анеуплоидных стволовых клеток. ≈ще труднее идентифицировать малочисленные тетраплоидные стволовые клетки, поскольку такие клетки в G1-фазе по содержанию ƒЌ  равноценны диплоидным клеткам в фазе G2. “ак, в отличие от рис 1, Ѕ, на котором четко виден высокий Ђтетраплоидныйї пик, на рис.1, ј обнаруживаетс€ лишь слабый пик, соответствующий четырем гаплоидным наборам ƒЌ .

††† ќпределение доли клеток, наход€щихс€ в S-фазе

ƒл€ определени€ доли клеток в S-фазе используетс€ метод Ѕайсха и др.(H.Baisch, W.Gohde, W.A.Linden, 1975), модифицированный применительно к анеуплоидным клеткам. —уть метода состоит в построении пр€моугольника, вписывающегос€ в пространство между G1- и G2-пиками. ¬ысота этого пр€моугольника определ€етс€ числом клеток, приход€щихс€ на 10 центральных каналов области S-фазы, из которого вычисл€етс€ среднее число клеток на канал. јналогичным способом можно определить долю анеуплоидных клеток в S-фазе при условии, что высоту пр€моугольника (рис.1, Ѕ) можно вычислить, использу€ ту часть гистограммы, котора€ не перекрываетс€ с областью, отвечающей диплоидным клеткам.

††††††† †3. јнализ параметров клеточного цикла

†††††††† Ѕлагодар€ фундаментальным исследовани€м в области экспериментальной биологии и клинической медицины были получены факты, касающиес€ кинетики клеточного цикла.

†††††††   насто€щему времени уже накоплен определенный опыт работы по данному вопросу. ѕрактически не существует ни одного органа или ткани человеческого организма, экспериментального животного, который бы не подвергалс€ цитометрическому или цитоспектрофотометрическому анализу. Ќа основании этих данных† установлено, что содержание ƒЌ  нормальных соматических клеток соответствует диплоидному набору хромосом (2с) и характеризуетс€ одним модальным классом на ƒЌ -гистограмме. «начение† этого параметра дл€ одного и того же индивида может колебатьс€ в пределах 30%. Ќаиболее выраженные вариации в содержании ƒЌ  наблюдаютс€ в клетках пролиферирующих органов Ц печени и селезенки. Ёти данные были получены при определении содержани€ ƒЌ  в €драх клеток различных органов и тканей фенотически здоровых людей (130 проб Ц по 5 Ц 14† от каждого случа€)(E.Muller, R.Weidhase, 1983).

¬ изучаемых объектах схематически представлены фазы митотического цикла и распределение ƒЌ  в различных ткан€х. –ассчитывалась кинетика клеточной пролиферации, а в патологически измененном органе Ц степень выраженности процесса, особенно в случае раковой опухоли.

Ѕлагодар€ использованию в исследовани€х сканирующих и проточных цитофотометров определены важные данные, касающиес€ классификации клеток по фазам митотического цикла, а также получены результаты, позвол€ющие оценить продолжительность и дисперсию соответствующих фаз цикла G1, S, G2+M.

ќднопараметрический анализ кинетики клеточного цикла по изучению содержани€ ƒЌ  показал возможности количественной цитометрии и открыл широкие перспективы относительно его использовани€ дл€ исследовани€ и углублени€ знаний по изучаемому вопросу.

¬ насто€щее врем€ по€вились данные, которые значительно расшир€ют традиционное представление, касающеес€ распределени€ клеток в четырех последовательных фазах цикла. ќдновременное изучение двух параметров Ц ƒЌ  и белка, ƒЌ  и –Ќ  Ц дает существенно больше информации о кинетике клеточного цикла, так как позвол€ет разделить сливающиес€ фазы цикла, такие, как G0+ G1, G2+M, а также идентифицировать дополнительные фазы в пресинтетическом (G1) и постсинтетическом (G2) периодах. ѕри анализе пресинтетического периода в эксперименте† и клиническом материале была показана возможность использовани€ јќ (ƒЌ  и –Ќ ) дл€ дополнительной классификации G1-периода на GIQ, GIA, GIB и G2A, G2B (Z.Darzynkiewicz, F.Traganos, M.R. Melamed, 1980).

Ќа культуре клеток Hela с использованием меченых радиоактивных изотопов и проточной цитометрии† выделены в постсинтетическом периоде клетки, относ€щиес€ к ранней (G2A) †и поздней (G2B) фазам клеточного цикла (O.C.Blair, R.T.Winward, J.L.Roti, 1979).

Pollack и др. (A.Pollac, H.Moulis, N.L.Block, G.L.Irvin, 1984) при цитометрическом анализе ƒЌ  и белка (FITC/PI) в клетках трех различных экспериментальных моделей, включающих культуру лейкозных опухолевых клеток крыс FL4, микрокультуру лимфоцитов периферической крови человека HPBL, не стимулированных и стимулированных фитогемагглютинином (‘√ј), а также материала солидной опухоли в виде перевивной аденокарциномы предстательной железы крыс R 3327=Q показал† возможность разделени€ пресинтетического периода на три фазы, выделив в нем поко€щиес€ клетки GIQ, ранние GIA †и поздние G2B клетки, в постсинтетическом периоде были соответственно выделены ранние G2ј и поздние G2B клетки. ƒл€ задержки вхождени€ клеток в S-фазу использовали актиномицидин D, оксимочевину, дл€ блока митотических клеток примен€ли колцемид.

¬ работе также представлены данные, свидетельствующие о† возможности классификации пролиферирующих лимфоидных и лейкозных опухолевых EL4-клеток в различные сроки культивировани€ на соответствующие S-фазы клеточного цикла с раздельным выделением в них M- и G2-фаз. »сход€ из представленных данных, очевидно, что проточный цитометрический анализ по двум параметрам €вл€етс€ одним из перспективных методов оценки кинетики клеточного цикла, позвол€ющий провести идентификацию клеток, наход€щихс€ в ранее неопредел€емых фазах цикла (G1A, G1B и G2A, G2B), и определить клетки, наход€щиес€ в фазах M и G2.

¬ некоторых работах клинического направлени€ используетс€ двухпараметрический анализ клеточного материала с достаточно успешной классификацией патологических процессов, например при распознавании доброкачественных и раковых процессов мочевого пузыр€, шейки матки, а также дл€ классификации различных форм гемобластозов.

¬ современной литературе весьма широко представлены данные по цитоспектрофотометрическому изучению интерфазных €дер. —ледует отметить, что особую ценность представл€ют работы, направленные на изучение митотических клеток с последующим анализом хромосом. »звестно, что изменени€, регистрируемые в хромосомах, могут быть определ€ющими диагностическими маркерами опухоли, особенно на начальных этапах возникновени€ злокачественного процесса. ќднако используемые методы анализа хромосомного материала сравнительно сложны и трудоемки. ѕоэтому в последнее врем€ нар€ду с обычными цитогенетическими методами исследовани€ кариотипа нормальных и малигнизированных клеток стали примен€тьс€ сканирующие и проточные цитометрические анализаторы. ѕриборы последнего типа обеспечивают достаточно высокую точность и скорость измерени€, а также воспроизводимость результатов. —корость анализа хромосом в протоке составл€ет 1000 Ц 2000 хромосом в секунду. ѕроточный цитометрический анализ ƒЌ  метафазных хромосом в суспензии €вл€етс€ совершенно новым методом кариотипировани€. ѕоэтому в исследовани€х такого рода основной акцент делаетс€ на разработке эффективных методов сепарации интактных хромосом с сохранением их целостности и морфологической структуры.

¬ представленных работах чаще всего изучаемой моделью €вл€ютс€ метафазные хромосомы, полученные из клеток китайского хом€чка и человека, приготовленные дл€ пр€мого кариотипировани€, а также дл€ анализа кариотипа с кратковременным или длительным культивированием клеток. ƒл€ анализа генетического материала используютс€ однопараметрические† проточные системы, где проводитс€ анализ и сортировка хромосом по интенсивности флуоресценции в комплексе с такими флуорохромами, как PI, EtBr, Ho 33258, а также примен€ютс€ высокоразрешающие проточные цитометры с двухлазерной системой, которые обеспечивают бивариантный анализ ƒЌ , меченный двум€ флуорохромами. Ѕольшей частью используют сочетание Ќо 33258, специфически св€зывающийс€ с ј“-богатыми участками ƒЌ , и хромомицин ј3, селективно взаимодействующий с √÷-парами.

ƒанные, полученные при помощи автоматизированных систем, представл€ютс€ в виде гистограмм, так называемых проточных кариограмм. ќ качестве анализа свидетельствует высокое разрешение гистограмм,  оторые характеризуютс€ множественными узкими пиками, относ€щимис€ к различным классам хромосом.  оличество пиков в большинстве случаев соответствует набору хромосом, которое характерно дл€ данного индивидуума. ѕри исследовании клеток зародыша китайского хом€чка методом проточного кариотипировани€ на этапе экспоненциального роста были получены все 11 пиков, соответствующие 11 парам хромосом самки, исследуемого животного (J.A.Steinkamp, 1984).

ќбычно примен€емые цитогенетические методы не позвол€ют идентифицировать Y-хромосому из G- и F-групп хромосом человека. ѕрименение проточной цитометрии позвол€ет решить эту задачу. “ак, на лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров-мужчин, с кратковременным культивированием (52 ч) и добавлентем колцемида была показана возможность определени€ позиции Y-хромосомы по интенсивности ƒЌ -флуоресценции (Ќо 33258) в виде пика на проточной кариограмме. ” 17 обследуемых доноров позици€ Y-хромосомы на гистограмме варьировала. ¬ некоторых наблюдени€х пик Y-хромосомы находилс€ между 19 и 20 хромосомами, в других Ц между 20-й и 17-й. ¬ 70% случаев Y-хромосома была контаминирована с 20-й.

»з работ, посв€щенных хромосомному анализу, известно, что при использовании однолазерной проточной системы может быть идентифицировано около 15 хромосом человека, исключа€ Y-хромосому. ѕрименение двухлазерной системы (FACS-11) позвол€ет по интенсивности флуоресценции распознать около 20 попул€ций хромосом в метафазных пластинках и, что особенно ценно, идентифицировать маленькие аутосомы человека (M.Lalande, R.R.Schreck, R.Hoffman, S.A. Latt, 1985). ¬ этом случае помимо флюорохромов Ќо 33258 и хромомицина ј3 в комплекс субстрат-флюорохром вводитс€ третий краситель: нетропсин или дистамицин ј. Ёто способствует получению дополнительной информации о специфике хромосом, т.е. определению структурных особенностей нормальных и атипических хромосом. ¬ результате бивариантного проточного анализа с дополнительной окраской хромосом авторам удалось на модели клеточной линии человеческих лимфобластов получить высокое разрешение метафазных пластин с последующим изучением структурной перестройки хромосом и идентификацией аномальных.

ѕроточный бивариантный анализ, используемый дл€ кариотипа хромосом, апробирован на достаточно широком спектре клинического и экспериментального материала, включа€ опухоль пр€мой кишки, культуры клеток асцитической жидкости, лимфоцитов периферической крови† и фибробластов человека (V.G.Enchev, K.G.Tsanev, 1985).

4.Ќаиболее употребительные методики, используемые в цитометрии клеточного цикла.

ѕри проточной цитометрии можно сканировать от 100 до нескольких тыс€ч клеток в секунду, что позвол€ет очень быстро получить достоверные результаты. ќднако таким способом можно анализировать только очень разбавленные клеточные суспензии. —олидные ткани необходимо сначала дезагрегировать, что всегда сопровождаетс€ нарушением морфологии.  летки моносло€ обычно диспергируют обработкой трипсином в присутсвии Ёƒ“ј.

 

ƒезагрегаци€ свежих солидных опухолей

ћетоды дезагрегации клеток можно подразделить на три группы:

Ц       ;

Ц       ;

Ц       методы выделени€ €дер

†—амые простые и быстрые методы дезагрегации включают только механическую обработку тканей. Ёти методы особенно хороши дл€ рыхлых тканей (например, лимфатических узлов) и позвол€ет получать густые суспензии клеток за несколько минут. ƒл€ получени€ неочищенных клеточных суспензий можно использовать аспираты солидных опухолей, вз€тые с помощью шприца.

‘ерментативный метод позвол€ет получить достаточно концентрированную клеточную суспензию из разнообразных опухолей, но при больших затратах времени.

ƒл€ выделени€ €дер (обычно из тканей, частично дезагрегированных механическим путем) разработаны различные методы, основанные† на использовании ферментов, детергентов или тех и других. ƒетальна€ процедура дезагрегации тканей, окрашивани€ препаратов, получени€ результатов и их анализа дл€ суспензии €дер разработана ¬инделовом и др. (L.L.Vindelov, I.J.Christensen, 1990).

÷ель дезагрегации состоит в получении с высоким выходом суспензии интактных изолированных клеток или €дер, достаточно хорошо соответствующей исходному образцу ткани. ¬ыбор способа дезагрегации зависит от типа ткани, размеров препарата, целей исследовани€, а иногда от быстроты и стоимости метода.

—успендирование архивных препаратов, залитых в парафин

ћетодика исследовани€ ƒЌ  с помощью проточной цитометрии суспензии €дер, полученной из заключенных в парафин архивных препаратов, была впервые описана в 1983 г. (D.W.Hedley, M.L.Friedlander, I.W.Taylor, 1983). Ёту методику можно использовать в модифицированном виде дл€ анализа самых разнообразных опухолей. Ёто дает целый р€д преимуществ:

Ц       ;

Ц       ;

Ц       парафиновые срезы легко транспортировать, что позвол€ет проводить цитометрические исследовани€ в специальных центрах.

Ќедостатки метода состо€т в том, что:

Ц       ;

Ц      

 ачество результатов можно повысить, если немного усовершенствовать фиксацию тканей (C.E.Gillett, R.S.Camplejohn, S.M.O´Reily, 1990). ’ороший эффект дает фиксаци€ в формалине при нейтральном рЌ при 4º— в течение ночи. —ледует избегать нагревани€ ткани (если только оно не €вл€етс€ абсолютно необходимым при ее обработке) или неоправданно длительной фиксации.

ќкрашивание ƒЌ 

ѕри окрашивании клеточной ƒЌ  с целью последующего определени€ ее содержани€ с помощью проточной цитометрии следует учитывать:

Ц       специфичность красител€ по отношению к ƒЌ ;

Ц          : интенсивность флуоресценции и возможность ее регистрации имеющимис€ в продаже приборами;

Ц      

Ётим требовани€м отвечает целый р€д флуорохромов. ƒетальное их описание дано в работах Waggoner A.S. (1990), Crissman H.A., Steincamp J.A. (1990), Laff S.A., Langolis R.J. (1990). ¬ проточной цитометрии дл€ окрашивани€ ƒЌ  чаще других флуорохромов используетс€ иодистый пропидий (»ѕ) даже несмотр€ на то, что он не строго специфичен по отношению к ƒЌ . — помощью »ѕ можно окрашивать также двухцепочечную –Ќ . —пектральные характеристики »ѕ очень удобны дл€ проточной цитометрии: дл€ возбуждени€ флуоресценции используетс€ обычный аргоновый лазер с рабочей длиной волны 488 нм, а максимум флуоресценции находитс€ вблизи 620 нм, что позвол€ет параллельно использовать флуоресцеин при проведении многопараметрических измерений.

Ќезависимо от красител€ последний должен находитьс€ с ƒЌ  в стехиометрических соотношени€х, т.е. количество св€занного с ƒЌ  красител€ должно быть пропорционально содержанию ƒЌ  в клетке. „тобы красителем были зан€ты все доступные дл€ св€зывани€ места, его следует брать в некотором избытке.

Ѕольшинство флуоресцирующих красителей, св€зывающихс€ с ƒЌ , в том числе и »ѕ, не могут проходить через мембраны интактных клеток. „тобы повысить проницаемость мембран, клетки либо фиксируют спиртом, либо обрабатывают детергентами.

»спользование другой ƒЌ  в качестве стандарта.

—одержание ƒЌ , которой отвечает один из пиков на ƒЌ -гистограмме дл€ исследуемого препарата, можно оценить, сравнив этот пик с пиком дл€ другой ƒЌ , содержание которой известно. “ак, сравнение левого пика на рис.1 с пиком, отвечающим ƒЌ  диплоидных лимфоцитов периферической крови человека, говорит о том, что мы имеем дело с диплоидными клетками. ¬ докладе  омитета по номенклатуре в аналитической цитометрии рекомендуетс€ использовать лимфоциты в качестве независимого стандарта ƒЌ . »звестны и другие случаи, когда стандартом служат €дерные эритроциты не млекопитающих, а других животных.

≈сли используютс€ €дра, выделенные из заключенных в парафин препаратов, то независимые ƒЌ -стандарты примен€ть нельз€. Ёто св€зано с неодинаковым окрашиванием ƒЌ  в €драх, выделенных из разных парафиновых блоков, вследствие различий в процедурах фиксации и обработки тканей. ≈сли на ƒЌ -гистограммах препаратов, заключенных в парафин, наблюдаетс€ два G1-пика, то левый из них условно считаетс€ соответствующим диплоидным клеткам (рис.1, Ѕ). Ёто не мешает вы€влению анеуплоидных клеток, поскольку все образцы содержат внутренний† контроль Ц диплоидные клетки (лимфоциты, эндотелиальные клетки и т. д.). Ќо в результате некоторые образцы ошибочно классифицируютс€ как Ђгиперплоидныеї, хот€ на самом деле €вл€ютс€ Ђгипоплоиднымиї.  линическа€ значимость такой неправильной классификации неизвестна, но в любом случае ее веро€тность невелика.

5.ѕрименение цитометрии в молекул€рной клинической диагностике.

Ќа первых порах основным стимулом к развитию проточной цитометрии послужило желание автоматизировать цитологические методы, использующиес€ дл€ диагноза заболеваний, но большинство опубликованных к насто€щему времени работ посв€щено применению этого метода дл€ прогностических целей. »нтенсивное развитие автоматизированных диагностических систем сканирующего и проточного типов способствовало быстрейшему внедрению цитометрического метода исследовани€ в клиническую практику. ¬ процессе развити€ и освоени€ метода происходит его специализаци€ по трем ведущим направлени€м. ѕервое Ц это массовые профилактические осмотры населени€ с целью вы€влени€ ранних стадий заболевани€, второе Ц дифференциальна€ диагностика пограничных состо€ний и злокачественного роста, третье Ц контроль динамики опухолевого заболевани€ в ходе проведени€ лекарственной, лучевой и комбинированной терапии, а также хирургического метода лечени€. ќсобенно плодотворно ведутс€ цитометрические исследовани€ в области гематологии, гинекологии, урологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, метод также используетс€ дл€ диагностики патологических процессов молочной и щитовидной желез.

»з истории количественной цитометрии известно, что одним из первых объектов изучени€ были форменные элементы крови и эпителиальные клетки слизистой оболочки шейки матки. ƒанное обсто€тельство св€зано с доступностью получени€ диагностического материала, разнообразием клеточных элементов, характеризующих нормальное физиологическое состо€ние исследуемых объектов, а также с трудностью морфологической идентификации их при различных патологических процессах, особенно онкологических заболевани€х.

†√инекологи€

ƒостаточно большой опыт применени€ количественной цитометрии в области гинекологии† позвол€ет выделить несколько этапов в развитии количественного метода оценки морфологических особенностей эпителиальных клеток шейки матки. ѕервый этап характеризуетс€ исследовани€ми, в которых рассматриваетс€ возможность осуществлени€ цитоскрининга, т.е. разграничение патологических процессов на две группы Ђнорма Ц ракї. ¬торой этап св€зан с дифференциацией пограничных состо€ний шейки матки по анализу одного, двух критериев диагностики с последующим применением коррел€ционного анализа, построением двух- и трехпараметрических диаграмм зависимостей изучаемых признаков. “ретий этап исследований направлен на углубленную идентификацию клеток с изучением их структурных особенностей (интегральна€ оптическа€ плотность, содержание ƒЌ ), отражающих определенные состо€ни€ шейки матки при диспластических, метапластических† процессах, внутриэпителиальном и инвазивных формах рака. ѕолученные результаты могут послужить основой изучени€ механизмов перестройки эпителиального пласта в процессе его озлокачествлени€ и определени€ природы злокачественной трансформации клетки. ’арактеризу€ данное направление, можно подчеркнуть значимость цитометрических исследований и в области осуществлени€ контрол€ качества цитологической и гистологической диагностики заболеваний шейки матки, а также оценки степени репарации ткани в процессе лечени€. »сход€ из фундаментальных исследований, посв€щенных оценке более чем 196 качественных и количественных признаков €дра и клетки и общего фона препарата, определ€ют, что более значимы параметры, характеризующие морфологические особенности €дра (Ѕ.ћ.Ѕрамберга, ».я.«итаре, ƒ.ѕ.ѕлегере, Ё.’.—милтниекс,1970). ѕоэтому при количественном анализе препаратов обычно исход€т из информативности размерных и структурных характеристик €дра: изучают его площадь, периметр, объем, диаметр, определ€ют коэффициент формы и оптическую плотность, содержание ƒЌ , –Ќ  и белка в нем. Ќа основании данных проточной цитометрии установлено, что среди обследуемых пациентов с различной патологией шейки матки в 74,5% случаев имеютс€ кондиломатозные изменени€. ”становлен профиль типичной ƒЌ -гистограммы дл€ данной патологии шейки матки с высоким содержанием ƒЌ  в G0/G1-фазе и ранней S-фазе клеточного цикла. ѕолагают, что наблюдаемые изменени€ в ƒЌ -гистограмме можно рассматривать как про€вление папилломо-вирусной инфекции в этиологии кондиломы шейки матки (K.C.Tsou, D.H.Hong, M.Varello et al, 1984).

 роветворна€ система

ѕри цитометрическом анализе клеточных элементов крови используют критерии, которые включают довольно широкий спектр параметров. Ёто в первую очередь цитометрические маркеры с использованием специфических красителей на –Ќ , ƒЌ , различных ферментативных систем (эстеразу, фосфатазу). »спользуютс€ также размерные критерии, которые включают объем, площадь, периметр и диаметр €дра и цитоплазмы клеток, а также €дерно-цитоплазматическое отношение.

ѕри исследовании диагностического материала при острых и хронических формах лейкозов методами цитометрии обнаружены некоторые различи€ дл€ клеточных элементов той или иной группы гемобластозов. »спользу€ морфометрические методы оценки размерных признаков €дра и цитоплазмы бластных клеток, обнаружена строга€ коррел€ци€ величины клеток и FAB (франко-американо-британской)- классификации лейкозов. ѕри сопоставлении количественных данных, полученных при исследовании клеточных элементов при острых лимфобластном и миелобластном лейкозах, классифицируемых по морфологическим признакам на подгруппы ћ1 Ц ћ6 согласно FAB-классификации, определены различи€ между двум€ вариантами лейкозов, кроме подгруппы ћ2. –егистрируемые различи€ в размере бластных клеток св€заны с фазами клеточного цикла. ”становлено, что клетки при остром миелобластном лейкозе в S-фазе цикла характеризуютс€ большим размером €дра. ƒл€ этой же форме лейкоза, но подгруппы ћ1 характерна более мала€ дол€ клеток в S-фазе клеточного цикла (M.Efrench, P.A.Bryon, D.Fiere et al, 1981).

ћолочна€ железа

— целью повышени€ диагностических возможностей цитологического метода при добро- и злокачественных опухол€х молочной железы, определени€ их гистологических вариантов, разработки прогностических критериев заболевани€ Ц также используютс€ данные морфометрии и цитоспектрофотометрии. ѕри объективизации цитологических препаратов исход€ из информативности следующих признаков: диаметр, периметр и площадь €дра и цитоплазмы, €дерно-цитоплазматическое отношение, текстура хроматина, содержание ƒЌ  и –Ќ . Ќа основании цитометрических исследований установлены некоторые закономерности, характерные дл€ злокачественных форм опухолей молочной железы. Ёто вариабельность €дерно-цитоплазматического отношени€, нарастание размера €дра и содержани€ ƒЌ . ћежду двум€ последними показател€ми обнаружена коррел€ционна€ зависимость, характеризующа€с€ следующими особенност€ми. ѕоказано, что клетки с некоторой атипией, котора€ выражаетс€ в увеличении площади €дра, распредел€ютс€ различно по фазам клеточного цикла. ќколо 21% клеток, наход€щихс€ в области 4с ƒЌ -гистограммы, имеют площадь €дер свыше 125 мкм2. ѕри площади €дер от 50 до 100 мкм2 основна€ масса клеток находитс€ в G1-фазе цикла и только около 5% клеток приход€тс€ на гипердиплоидную область распределени€ ƒЌ  (C.J.Cornelisse, A.J.Van Driel-Kulker, F.Meyer, J.S.Ploem, 1985). ѕоказатель ƒЌ  (количество ƒЌ  в 1 клетке опухоли на количество ƒЌ  в нормальной клетке) в различных типах злокачественных опухолей молочной железы значительно варьирует, однако чаще наблюдаетс€ тетраплоиди€ (60 Ц 80%), доброкачественные опухоли, как правило, диплоидные. —равнительна€ оценка содержани€ ƒЌ  в клетках молочной железы при доброкачественных и раковых процессах показала определенную зависимость между соотношением клеток по фазам цикла. ”становлено, что с прогрессированием процесса количество диплоидных клеток в G1-фазе цикла убывает и при III Ц IV стадии ракового процесса составл€ет 64%.  оличество тетраплоидных клеток нарастает в 2 раза и составл€ет около 17% общего количества клеток по сравнению с пролиферативной формой мастопатии и в 3 раза по отношению к непролиферативной форме мастопатии.

†††

††††††††† «ј Ћё„≈Ќ»≈

††††† “аким образом, как проточна€, так и статическа€ цитометри€ позвол€ет исследовать многие важные параметры клеточного цикла. Ќаиболее распространенной задачей, решаемой с помощью данного класса приборов, €вл€етс€ идентификаци€ и подсчет клеток, наход€щихс€ в различных периодах клеточного цикла. ¬ последнее врем€ параллельно с этими параметрами с помощью цитометров исследуют также† динамику экспрессии многих важных клеточных маркеров, что может иметь диагностическое и прогностическое значение. ¬ажно отметить, что принципиальных различий между двум€ типами цитометрии, по-видимому, не существует. ѕоэтому с помощью достаточно простых и недорогих приборов можно воспроизводить весьма эффективные методики исследовани€ клеточного цикла, первоначально разработанные дл€ дорогосто€щих проточных цитометров. “акие системы статической цитометрии включают в себ€ люминесцентный микроскоп, черно-белую или цветную телевизионную камеру высокой чувствительности, устройство дл€ оцифровки телесигнала и компьютер. ¬ последнее врем€ в подобных системах все более широко примен€ютс€ цифровые телекамеры, которые подключаютс€ к компьютеру через высокопроизводительные порты нового поколени€ (универсальный последовательный порт). Ёто позвол€ет создавать недорогие и достаточно мощные системы дл€ статической цитометрии, которые могут успешно конкурировать как с проточными цитометрами, так с конфокальными микроскопами. ¬ целом можно сделать вывод о перспективности данного направлени€ в цитологии, дающего возможность широкого применени€ методов количественной микроскопии в научных исследовани€х и клинической практике.

†††

†††† Ћ»“≈–ј“”–ј

1.    

2.    

3.    

4.     / под пед. ƒж.  лауса-ћ., ћир, 393с.

5.    

6.    

7.     Baisch H., Gohde W., Linden W.A. (1975). Radiat. Environ. Biophis., 12, 31.

8.     †Blair O.C. Winward R.T., Roti J.L. The effect of hyperthermia on the protein content of Hela cell nuclei: A flow cytometric analysis // Radiat. Ress Ц 1979. Ц 78. Ц P. 474

9.     Cornelisse C.J., Van Driel-Kulker A.J., Meyer F., Ploem J.S. Automated recognition of atypical nuclei in breast cancer cytology specimens by iterative image transformation // J. Microsc. (Gr. Brit.). Ц 1985. Ц 137, N 1. Ц P. 101 Ц 110.

10.  Crissman H. A., Steinkamp J.A. (1990). ). In: Flow cytometry and sorting (2nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 227 Ц 247. Wiley Ц Liss, New York.

11.  Darzynkiewicz Z., Traganos F., Melamed M.R. New cell cycle compartments identified by multiparameter flow cytometry // Cytometry. Ц 1980. Ц 1, N 1. Ц P.98.

12.  Efrench M., Bryon P.A., Fiere D. Et. Al. Quantitative cytology of acute adult leukemia // Transplant Clin immunol. Ц XIII, Excerpta† Medica. Ц 1981. Ц P. 224 Ц 228.

13.  Enchev V.G., Tsanev K.G. Comparative cytomorphometric and cytospectrophotometric investigations of gastric lesions // Ibid. Ц 1985. Ц 55, N 1. Ц P. 37 Ц 46.

14.  Gillett C.E., Camplejohn R.S., O´Reily S.M. (1990). J. Pathol., 160, 173A.

15.  Hedley D.W., Friedlander M.L., Taylor I.W., Rugg C.A., Musgrove E.A. (1983). J. Histochem. Cytochem., 31, 1333.

16.  HoddemanW., Schumann J., Andreeff M., Barlogie B., Herman C.J., Lief R.C. et. Al. (1984). Cytometry, 5, 445.

17.  Jacobberger J.W., Sramkoski R.M., Wormsley S.B., Bolton W.E. Estimation of kinetic cell-cycle-related gene expression in G1 and G2 phases from immunofluorescence flow cytometry data/ Cytometry, 1999, 35, 284-289.

18.  Laff S.A., Langolis R.J. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp.249 Ц 290 . Wiley Ц Liss, New York.

19.  Lalande M., Schreck R.R., Hoffman R., Latt S.A. Identification of inverted duplicated 15 chromosomes using bivariate flow cytometric analysis // Cytometry. Ц 1985. Ц 6, N 1. Ц P. 1 Ц 6.

20.  Muller E., Weidhase R. Impulscytophotometrische Untersuchungen zum DNS-Gehalt in Humanen Zellkernen // Wiss. Beitr. M. Ц Luther-Univ. Halle-Wittenberg. Ц 1983. Ц 32, N 2. Ц S.† 3 Ц 8.

21.  Ormerod M.G. (ed.) (1990). Flow cytometry; A practical approach. IRL Press, Oxford.

22.  Pollack A., Moulis H., Block N.L., Irvin G.L. Quantitation of Cell Kinetic Responses Using Simultaneous Flow Cytometric Measurements of DNA and Nuclear Protein //Cytometry. Ц 1984. Ц 5, N 5. Ц P. 473 Ц 481.

23.  Steinkamp J.A. Flow cytometry // Rev. Sci. Instrum. Ц 1984. Ц 55, N 9. Ц P. 1375 Ц 1400.

24.  Tsou K.C., Hong D.H., Varello M. et. al. Flow cytometric DNA analysis as a diagnostic aid for cervical condyloma and cancer // Cancer. Ц 1984. Ц 54, N 9. Ц P. 1778 Ц 1787.

25.  Van Dilla M.A., Trujillo T.T., Mullaney P.F., CoulterJ.R. (1969). Science, 163, 1213.

26.  Vindelov L.L., Christensen I.J. (1990). Cytometry, 11, 753.

27.  Waggoner A.S. (1990). In: Flow cytometry and sorting (2nd edn.) (ed. M.R. Melamed, T. Lindmo and M.L Mendelson), pp. 209 Ц 225. Wiley Ц Liss, New York.

Ѕ≈Ћќ–”—— »…†† √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌџ…†† ”Ќ»¬≈–—»“≈“ Ѕиологический факультет кафедра генетики и биотехнологии »——Ћ≈ƒќ¬јЌ»≈†  Ћ≈“ќ„Ќќ√ќ† ÷» Ћј† ћ≈“ќƒќћ ѕ–ќ“ќ„Ќќ…† ÷»“ќћ≈“–»» †††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††

 

 

 

¬нимание! ѕредставленна€  урсова€ находитс€ в открытом доступе в сети »нтернет, и уже неоднократно сдавалась, возможно, даже в твоем учебном заведении.
—оветуем не рисковать. ”знай, сколько стоит абсолютно уникальна€  урсова€ по твоей теме:

Ќовости образовани€ и науки

«аказать уникальную работу

ѕохожие работы:

ѕриспособление растений к водному режиму
Ќасто€щее и будущее биосенсоров
–азноспоровость у высших растений
–азнообразие строени€ цветков и плодов у семейства –озоцветные
—елекци€ и семеноводство сельдере€ и фасоли
¬одно болотна€ орнитофауна ”краины и еЄ охранный статус (¬одно-болотна орн≤тофауна ”крањни та њњ охоронний статус)
–егистраци€ сигнальных молекул
ѕолучение моноклональных антител
Ѕиологические особенности дво€кодышащих и кистепЄрых рыб
Ѕиологические особенности акул

—вои сданные студенческие работы

присылайте нам на e-mail

Client@Stud-Baza.ru