Ѕаза знаний студента. –еферат, курсова€, контрольна€, диплом на заказ

курсовые,контрольные,дипломы,рефераты

»стори€ и методологи€ клонировани€ — Ѕиологи€

ѕосмотреть видео по теме –еферата

Ёта тема прекрасно отражена в статье  онюхова Ѕориса ¬ладимировича - доктора биологических наук, заведующего лабораторией генетики развити€ »нститута общей генетики имени Ќ.». ¬авилова. «десь € просто приведу еЄ текст :

ƒолли - случайность или закономерность?

“ермин "клон" происходит от греческого слова "klon", что означает - веточка, побег, черенок, и имеет отношение прежде всего к вегетативному размножению.  лонирование растений черенками, почками или клубн€ми в сельском хоз€йстве, в частности в садоводстве, известно уже более 4-х тыс. лет. Ќачина€ с 70-х годов нашего столети€ дл€ клонировани€ растений стали широко использовать небольшие группы и даже отдельные соматические (неполовые) клетки.

ƒело в том, что у растений (в отличие от животных) по мере их роста в ходе клеточной специализации - дифференцировки - клетки не тер€ют так называемых тотипотентных свойств, т.е. не тер€ют своей способности реализовывать всю генетическую информацию, заложенную в €дре. ѕоэтому практически люба€ растительна€ клетка, сохранивша€ в процессе дифференцировки свое €дро, может дать начало новому организму. Ёта особенность растительных клеток лежит в основе многих методов генетики и селекции.

ѕри вегетативном размножении и при клонировании гены не распредел€ютс€ по потомкам, как в случае полового размножени€, а сохран€ютс€ в полном составе в течение многих поколений. ¬се организмы, вход€щие в состав определенного клона, имеют одинаковый набор генов и фенотипически не различаютс€ между собой.

 летки животных, дифференциру€сь, лишаютс€ тотипотентности, и в этом - одно из существенных их отличий от клеток растений.  ак будет показано ниже, именно здесь - главное преп€тствие дл€ клонировани€ взрослых позвоночных животных.

ѕервые опыты на амфиби€х

¬озможность клонировани€ эмбрионов позвоночных впервые была показана в начале 50-х годов в опытах на амфиби€х. јмериканские исследователи Ѕриггс и  инг разработали микрохирургический метод пересадки €дер эмбриональных клеток с помощью тонкой стекл€нной пипетки в лишенные €дра (энуклеированные) €йцеклетки [1]. ќни установили, что если брать €дра из клеток зародыша на ранней стадии его развити€ - бластуле, то примерно в 80% случаев зародыш благополучно развиваетс€ дальше и превращаетс€ в нормального головастика. ≈сли же развитие зародыша, донора €дра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то лишь менее чем в 20% случаев оперированные €йцеклетки развивались нормально. Ёти результаты позже были подтверждены и в других работах.

Ѕольшой вклад в эту область внес английский биолог √ердон. ќн первым в опытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis (1962) в качестве донора €дер использовал не зародышевые клетки, а уже вполне специализировавшиес€ клетки эпители€ кишечника плавающего головастика [2]. ядра €йцеклеток реципиентов он не удал€л хирургическим путем, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. ¬ большинстве случаев реконструированные €йцеклетки не развивались, но примерно дес€та€ часть их них образовывала эмбрионы. 6,5% из этих эмбрионов достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика и только 1% развилс€ в половозрелых особей (рис. 1). ќднако по€вление нескольких взрослых особей в таких услови€х могло быть св€зано с тем, что среди клеток эпители€ кишечника развивающегос€ головастика довольно длительное врем€ присутствуют первичные половые клетки, €дра которых могли быть использованы дл€ пересадки. ¬ последующих работах как сам автор, так и многие другие исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.

ѕозже √ердон модифицировал эксперимент [3]. ѕоскольку большинство реконструированных €йцеклеток (с €дром клетки кишечного эпители€) погибают до завершени€ стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них €дра на стадии бластулы и снова пересадить их в новые энуклеированные €йцеклетки (така€ процедура называетс€ "серийной пересадкой" в отличие от "первичной пересадки"). „исло зародышей с нормальным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в результате первичной пересадки €дер.

«атем √ердон вместе с Ћаски (1970) стали культивировать in vitro (вне организма в питательной среде) клетки почки, легкого и кожи взрослых животных и использовать уже эти клетки в качестве доноров €дер [4]. ѕримерно 25% первично реконструированных €йцеклеток развивались до стадии бластулы. ѕри серийных пересадках они развивались до стадии плавающего головастика. “аким образом было показано, что клетки трех разных тканей взрослого позвоночного (X. laevis) содержат €дра, которые могут обеспечить развитие по крайней мере до стадии головастика.

¬ сною очередь ƒиЅерардино и ’офнер использовали дл€ трансплантации €дра недсл€щихс€ и полносгью дифференцированных клеток крови - эритроцитов л€гушки Rana pipiens [5]. ѕосле серийной пересадки таких €дер 10% реконструированных €йцеклеток достигали стадии плавающего головастика. ќднако даже с помощью многократных серийных пересадок (более 100 клеточных циклов) реконструированные €йцеклетки дальше стадии головастика не развивались.

“аким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами €дер могут быть лишь зародыши на ранних стади€х развити€. Ќекоторые авторы называют подобные эксперименты клонированием амфибий, хот€ правильнее называть их клонированием эмбрионов амфибий, так как в этом случае мы размножаем бесполым путем не взрослых животных, а зародышей.

ƒифференцировка клеток в ходе развити€ позвоночных сопровождаетс€ инактивацией неработающих генов. ѕоэтому клетки тер€ют тотипотентность, дифференцировка становитс€ необратимой. ¬ конце концов у одних клеток происходит полное репрессирование генома, у других - в той или иной степени деградирует ƒЌ , а в некоторых случа€х разрушаетс€ даже €дро. ќднако нар€ду с дифференцированными кочетками культивируемые in vitro клеточные попул€ции содержат малодифференцированные стволовые клетки, которые и могут быть использованы как доноры €дер дл€ клонировани€ млекопитающих.

ќпыты с амфиби€ми показали, что €дра различных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки постепенно тер€ют способность обеспечивать развитие реконструированных €йцеклеток, однако серийные пересадки €дер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.

Ќеудачи экспериментов с мышами

”спешные опыты с амфиби€ми заставили ученых задуматьс€ о клонировании эмбрионов млекопитающих, в частности мышей. ћак иннел в одной из своих работ отмечал, что все необходимые дл€ этого методы уже существуют, и непон€тно, почему мышь до сих пор не клонирована. ѕо его мнению, первыми объектами должны были стать именно мелкие животные, такие как мышь или кролик. ќднако предсказание ћак иннелла не сбылось, хот€ в конце 70-х годов опыты на мышах действительно начались и протекали весьма драматично.   тому времени, замечу, весьма основательно были изучены биологи€ и генетика ранних этапов развити€ млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объекта.

–абота методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем €йцеклетки у млекопитающих примерно в тыс€чу раз меньше, чем у амфибий. ќднако эти трудности были успешно преодолены. Ёкспериментаторы научились микрохирургически удал€ть пронуклеусы [6] из зигот (оплодотворенных €йцеклеток) мыши и пересаживать в них клеточные €дра ранних эмбрионов. ќднако все полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до стадии бластоцисты [7].

6. ѕронуклеус - одно из двух гаплоидных €дер в €йце млекопитающих в период после проникновени€ сперматозоида, но до сли€ни€ мужского и женского пронуклеусов в €дро зиготы в процессе оплодотворени€. ћужское €дро формируетс€ из €дерного материала сперматозоида, женское - из хромосом €йцеклетки.

7. Ѕластоциста (бластула) - зародыш млекопитающих на одной из ранних стадий развити€, еще до его имплантации в матку.

¬ 1977 году по€вилось сенсационное сообщение ’оппе и »лменси о том, что они получили семь взрослых самок мышей, п€ть из которых имели голько магеринский, а две - отцовский геном [8]. Ёто, €кобы, зависело от гого, какой пронуклеус был оставлен в €йце - женский или мужской, он и определ€л развитие особи но типу гиногенеза или андрогенеза. »х успех был св€зан, но описанию авторов, с гем, что, удал€€ один нронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатыва€ €йца специальным веществом, затем выращивали полученные диплоидные гомочиготные (с двум€ одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента дл€ дальнейшего развити€.

 азалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной гомозиготностью по всем генам. Ёто особенно важно в селекции, так как дл€ получени€ сельскохоз€йственных животных, в частности, крупного рогатого скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуютс€ дес€тки лет работы.

ќднако, к сожалению, данные ’оппе и »лменси подтвердить не удалось, хот€ многие пытались это сделать. ќказалось, что полученные любым способом диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на тех же стади€х, что и диплоидные партеногенетические (развивающиес€ из неоплодотворенной €йцеклетки) эмбрионы.

«начительно усовершенствовав методы извлечени€ €дер и введени€ их в клетку, ћак√рат и —олтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров €дер использовали зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструированные €йцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластоцисты [9].

ћетод ћак√рата и —олтера стал широко использоватьс€ разными экспериментаторами. “ак, ћанн и Ћовел-Ѕадж выдел€ли пронуклеусы из €иц, активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы мышей [10]. ¬ этих случа€х эмбрионы погибали на ранних стади€х. ≈сли же наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворенных €иц и пересаживали в партеногенетически активированные и лишенные €дра €йца, то такие зародыши развивались нормально до рождени€. —урани с соавторами установили, что если добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом €йцеклетки, то нормального развити€ не происходит, добавление же мужского €дра приводит к нормальному развитию [11]. — другой стороны, рекомбинации мужского и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных €йцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинаци€ двух мужских или двух женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона [12].

Ёти опыты показали, что дл€ нормального развити€ млекопитающих требуютс€ два набора хромосом - отцовский и материнский. ѕоэтому ни у одного из известных видов млекопитающих не описан партеногенез. ѕоэтому работы ’оппе и »лменси не удалось повторить.

ќднако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. ¬ 1982 году они пересадили €дра клеток партеногенетических бластоцист мышей в энуклеированные зиготы Ќекоторые из этих реконструированных €йцеклеток нормально развивались, и €кобы были получены четыре взрослых самки. ¬ свете вышесказанного эти результаты весьма маловеро€тны.

√ибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических зародышей у млекопитающих св€зана с различной активностью в онтогенезе материнского и отцовского геномов. ћеханизм, регулирующий эти функциональные различи€, был назван геномным импринтингом [13] и изучалс€ в р€де работ, где было показано, что дл€ нормального развити€ млекопитающих требуетс€ наличие мужского генома. ƒруга€ стать€ »лменси и ’оппе [14] имела еще больший резонанс.

јвторы сообщили о пересадке €дер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и самца), генетически идентичных донорской линии мышей. ¬ведение €дер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затем реконструированные €йцеклетки культивировали in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. »з 16-ти пересаженных бластоцист три развились во взрослых животных. ¬ следующей работе (1982) эти же авторы использовали в качестве доноров €дер клетки эмбрионов еще более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. ќднако никто из работающих в том же направлении не смог добитьс€ подобных результатов, и достоверность данных »лменси и ’оппе была вновь поставлена под сомнение.

ћак√рат и —олтер показали, что €дра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированных €йцеклеток даже до стадии морулы, котора€ предшествует стадии бластоцисты [15]. Ќебольша€ часть (5%) €дер 4-клеточных зародышей дает возможность развиватьс€ только до стадии морулы. ¬ то же врем€ 19% реконструированных €йцеклеток, содержащих €дра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы или бластоцисты.

Ёти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные €дра рано тер€ют тотипотентность, что св€зано очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. ” других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активаци€ первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. ¬озможно поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. “ем не менее, работы с мышами, несмотр€ на их непростую судьбу, значительно расширили наши представлени€ о методологии клонировани€ млекопитающих.

 ролики, коровы и свиньи

јмериканские исследонатели —тик и –обл, использу€ методику ћак√рата и —олтера, получили 6 живых кроликов, пересадив €дра 8клеточных эмбрионов одной породы в лишенные €дра €йцеклетки кроликов другой породы [16]. ‘енотип родившихс€ полностью соответствовал фенотипу донора.

ќднако только 6 из 164 реконструированных €йцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Ёто, конечно, очень низкий выход, практически не позвол€ющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных. ÷енность этой работы тем не менее в том. что она показала возможность клонировани€ эмбрионов кроликов.

–абота с реконструированными €йцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. »х сначала культивируют не in vitro, a in vivo - в перев€занном €йцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. «атем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождени€ детеныша. ”иладсин предложил заключать реконструированные €йцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перев€занный €йцевод овцы [17]. ѕо данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваютс€ в €йцеклетке, чем в культуральной среде, хот€ некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании.

јмериканцы –обл и его сотрудники, использу€ щад€щий метод извлечени€ €дра без прокалывани€ мембраны €йцеклетки, предложенный ћак√ратом и —олтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также €дра 2-, 4- или 8-клеточных эбрионов коровы [18]. —начала зиготы центрифугировали чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего €дра были хорошо видны под микроскопом (рис. 2а), что значительно облегчало их удаление (рис. 2б). ѕри помощи манипул€тора и заостренной стекл€нной микропипетки извлекали один из бластомеров вместе с €дром из ранних зародышей (рис. 2в) и переносили его в энуклеированную зиготу (рис. 2г).

–еконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перев€занный €йцевод овцы. „ерез п€ть дней культивировани€ их вымывали, освобождали от агара и исследовали. –еконструктурированные зародыши в этой работе развивались только в тех случа€х, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. ƒва зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых тел€т. ≈сли в качестве доноров использовали €дра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные €йцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

ѕозже были и более успешные работы. ”иладсин, в частности. сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные €йцеклетки €дер бластомеров одного 32-клеточного зародыша [19] (рис. 3). јвтор утверждал, что большинство €дер сохран€ет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительна€ их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечива€ нормальное развитие реконструированных €йцеклеток до стадии ранней бластоцисты в €йцеводе овцы. ѕосле пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиватьс€.

Ѕондиоли и соавторы, использу€ в качестве доноров €дер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка [20]. —емь из них были генетически идентичны, представл€€ собой клон, полученный в результате пересадки €дер клеток одного донорского эмбриона.

“аким образом, клеточные €дра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохран€ют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных €йцеклеток. »наче говор€, методические трудности клонировани€ зародышей крупного рогатого скота практически решены. Ќо остаетс€ основна€ задача - найти донорские €дра, обладающие тотипотентностью, дл€ клонировани€ взрослых животных.

 лонированию эмбрионов свиней посв€щена только одна небольша€ работа [21]. —кудность данных, видимо.и св€зана с определенными трудност€ми работы с этим объектом.

 лонирование овец

”иладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной стадии развити€ €дра сохран€ют тотипотентность [22]. –еконструированные €йцеклетки, содержащие €дра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались нормально до стадии бластоцисты в перев€занном €йцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождени€ от агара и пересадки в матку овцы - второго реципиента - еще 60 дней. ¬ другом случае донорами служили €дра 8-клеточных зародышей и были получены 3 живых €гненка, фенотип которых соотнетстиовал породе овец - доноров.

¬ 1989 году —мит и ”илмут трансплантировали €дра клеток 16-клеточного эмбриона и ранней бластоцисты в лишенные €дра неоплодотворенные €йцеклетки овец [23]. ¬ первом случае было получено два живых €гненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров €дер. ¬о втором случае один полностью сформировавшийс€ €гненок погиб во врем€ родов. ≈го фенотип также соответствовал породе - донору. јвторы считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактиваци€ некоторых важных дл€ развити€ генов, в результате которой €дра бластоцисты уже не могут репрограммироватьс€ в цитоплазме €йцеклетки и обеспечить нормальное развитие реконструированного зародыша. ѕоэтому, по мнению авторов, в качестве доноров €дер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in vitro линии эмбриональных клеток, €дра которых обладают тотипотентностью.

ѕозднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством ”илмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами €дер которых была культура эмбриональных клеток [24].  леточную культуру получали следующим образом: выдел€ли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). —начала клеточна€ культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Ёта лини€ клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

„тобы донорское €дро и реципиентна€ цитоплазма находились на сходных стади€х клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и €дра этих клеток пересаживали в энуклеированные €йцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). –еконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перев€занные €йцеводы овец. „ерез 6 дней эмбрионы вымывали из €йцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. ќтбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождени€. –одилось 5 €гн€т (самок) из них 2 погибли вскоре после рождени€, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихс€ нормально развивались и достигли 8-9-мес€чного возраста. ‘енотипически все €гн€та были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Ёто подтвердил и генетический анализ.

Ёта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хот€ она и не вызвала столь шумного интереса, как стать€ того же ”илмута с соавторами, опубликованна€ в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использовани€ донорского €дра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке ƒолли [25]. ѕоследн€€ работа методически во многом повтор€ет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы.  летки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, наход€щейс€ на последнем триместре беременности. ¬се три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Ёмбриональные клетки использовали в качестве доноров €дер на 7-9-м пассажах культивировани€, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. ƒеление клеток всех трех типов останавливали на стадии GO и €дра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (€йцеклетки) на стадии метафазы II. Ѕольшинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перев€занном €йцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде.  оэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в €йцеводе. (ѕоэтому, видимо, нет строки необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro. ќднако дл€ полной уверенности в этом нужны дополнительные данные.)

¬ыход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сери€х, когда в качестве доноров €дер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. „исло живых €гн€т в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. ¬ серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных €йцеклеток был получен только один живой €гненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). јнализ генетических маркеров всех семи родившихс€ в трех сери€х экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами €дер дл€ одного, фибробласты плода - дл€ двух и эмбриональные клетки - четырех €гн€т. ќвца по кличке ƒолли развилась из реконструированной €йцеклетки, донором €дра которой была культивируема€ клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличаетс€ от овец этой породы, но сильно отличаетс€ от овцы-реципиента. јнализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

”спех авторов этой работы прежде всего св€зан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, веро€тно, и были использованы как доноры €дер. Ѕольшое значение также имел тот факт, что авторы, учитыва€ результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла €йцеклеток реципиентов и клеток доноров.

«аключение

»так, работы по клонированию позвоночных были начаты на амфиби€х в начале 50-х годов и интенсивно продолжаютс€ вот уже более четырех дес€тилетий. „то касаетс€ амфибий, то, как было сказано в соответствующем разделе, несмотр€ на значительные достижени€, проблема клонировани€ взрослых особей остаетс€ до сих пор не решенной. ”становлено, что в ходе клеточной дифференцировки у позвоночных происходит или потер€ определенных генных локусов или их необратима€ инактиваци€. —уд€ по всему, утрачиваетс€ та часть генома, котора€ контролирует не ранние, а более поздние этапы онтогенеза, в частности, метаморфоз амфибий. ћеханизм этого €влени€ пока не поддаетс€ научному объ€снению. Ќо очевидно, что дл€ клонировани€ взрослых позвоночных необходимо использовать малодифференцированные дел€щиес€ клетки. Ёто методически важное положение было учтено в более поздних работах.

¬ 1979 году американский биолог ћак иннел, внесший большой вклад в работу с амфиби€ми, утверждал, что полученные результаты не позвол€ют серьерно говорить о возможности клонировани€ человека [26] - тогда это казалось недоступным дл€ экспериментальных эмбриологов. ќднако еще в то врем€ многие ученые, писатели и даже политики стали активно обсуждать возможностт клонировани€ человека, а некоторые исследователи даже приступили к таким экспериментам. Ќапример, Ўеттлз сообщил, что пересадил €дро сперматогониальной клетки (диплоидного предшественника зрелого гаплоидного сперми€) в лишенную €дра €йцеклетку человека [27]. ¬ результате три реконструированные €йцеклетки начали дробление, и возникли похожие на морулы скоплени€ клеток, которые позднее деградировали. Ўеттлз полагал, что если трансплантировать такие группы клеток в матку женщины, то они могли бы нормально развиватьс€. ћак иннел тогда справедливо возразил, что такое предположение маловеро€тно и совершенно необоснованно.

≈ще 5-6 лет назад никто из ученых, а их работало довольно много в этой области, не ставил вопрос об использовании в качестве доноров €дер клеток взрослых млекопитающих. –аботы сводились, в основном, к клонированию эмбрионов домашних животных, и многие из этих исследований были не очень успешны. ѕоэтому так поразило по€вившеес€ в начале 1997 года неожиданное дл€ всех сообщение авторского коллектива под руководством ”илмута, что им удалось, использу€ соматические клетки взрослых животных, получить клональное животное - овцу по кличке ƒолли. Ќа самом деле, однако, исследователи прошли долгий путь, и ”илмуту с сотрудниками пришлось собрать воедино все существовавшие к тому времени достижени€, прежде чем они смогли сообщить о сенсационном результате своей работы.

” этого первого успешного эксперимента есть существенный недостаток - очень низкий коэффициент выхода живых особей (0,36%), и если учесть также высокий процент гибели развивающихс€ реконструированных €йцеклеток в плодный период развити€ (62%), который в 10 раз выше, чем при обычном скрещивании (6%), то встает вопрос о причинах гибели зародышей. ¬се ли пересаженные донорские €дра обладали тотипотентностью? —охран€лс€ ли полностью их функциональный геном (набор генов, необходимых дл€ развити€), все ли нужные дл€ развити€ гены были дерепрессированы? Ёто очень важные вопросы, и по одному животному нельз€ сделать окончательные выводы. “ем более, что результаты исследований на амфиби€х говор€т о необратимом характере инактивации, репрессии генов в ходе клеточной дифференцировки. ¬озможно, авторам крупно повезло, и они достаточно случайно в трех разных клеточных попул€ци€х отобрали за короткий срок стволовые клетки, дл€ которых характерна низка€ дифференцированность и способность к делению. „тобы подтвердить результат этой, в буквальном смысле слова с.енсационной работы, необходимы дополнительные исследовани€.

¬ ближайшие годы главна€ задача исследователей, работающих в данной области - это, по-видимому, создание культивируемых in vitro линий малодифференцированных стволовых клеток, характеризующихс€ высокой скоростью делени€. ядра именно таких клеток должны обеспечить полное и нормальное развитие реконструированных €йцеклеток, формирование не только морфологических признаков, но и нормальных функциональных характеристик клонированного организма.

»сследовани€ ”илмута и сотрудников имеют не только практическое, но и большое научное значение дл€ генетики развити€. ¬ сущности, они нашли услови€, при которых цитоплазма ооцитов млекопитающих может репрограммировать €дро соматической клетки, возвраща€ ей тотипотентность. ѕосле публикации этой работы сразу и широко стал дискутироватьс€ вопрос о возможности клонировани€ человека. „тобы его обсуждать, имеет смысл выделить два аспекта: методический и этический.

»з изложенного выше следует, что методически или технически клонирование взрослых млекопитающих разработано еще недостаточно, чтобы можно было уже сейчас ставить вопрос о клонировании человека. ƒл€ этого необходимо расширить круг исследований, включив в него. кроме овец. представителей и других видов животных. ”илмут с сотрудниками, например, планирует продолжить свои работы на коровах и свинь€х. “акие работы необходимы, чтобы установить, не ограничиваетс€ ли возможность клонировани€ взрослых млекопитающих особенност€ми или спецификой какого-либо одного или нескольких видов.

«атем необходимо существенно повысить выход жизнеспособных реконструированных эмбрионов и взрослых клонированных животных, вы€снить, не вли€ют ли методические приемы на продолжительность жизни, функциональные характерстики и плодовитость животных. ƒл€ клонировани€ человека очень важно свести к минимуму риск, который, тем не менее, в определенной степени все равно останетс€, риск дефектного развити€ реконструированной €йцеклетки, главной причиной которого может быть неполное репрограммирование генома донорского €дра.

„то касаетс€ этической строны дела, клонирование человека вызывает еще больше возражений. ¬о-первых, становление человека как личности, базируетс€ не только на биологической наследственности, оно определ€етс€ также семейной, социальной и культурной средой. ѕри клонировании индивида невозможно воссоздать все те услови€ воспитани€ и обучени€, которые сформировали личность его прототипа (донора €дра). ¬о-вторых, при бесполом размножении изначально жестка€ запрограммированность генотипа предопредел€ет меньшее разнообразие взаимодействий развивающегос€ организма с измен€ющимис€ услови€ми среды (по сравнению с половым размножением, когда в формировании индивида участвуют два генома, сложным и непредсказуемым образом взаимодействующие между собой и с окружающей средой). ¬ третьих, практически все религиозные учени€ настаивают, что по€вление человека на свет - в "руках" высших сил, что зачатие и рождение должно происходить естественным путем.

ѕодвод€ итоги, следует признать, что говорить о клонировании человека можно лишь сугубо теоретически. ¬ сущности речь идет даже не о клонировании, а о получении копии отдельного индивида, поскольку термин "клонирование" предполагает получение некоего множества особей. Ќо слово уже прижилось, поэтому имеет смысл пользоватьс€ им по прежнему. ќчевидно, что сегодн€ веро€тность отрицательных последствий этой процедуры значительно перевешивает ее выгоды, поэтому, по моему глубокому убеждению, работы по клонированию человека, как в насто€щее врем€, так и в ближайшем будущем проводить нецелесообразно.

¬озможно, через какое-то врем€, когда будут усовершенствованы все этапы этого сложного биотехнологического метода, ученые, социологи и другие заинтересованные лица смогут вернутьс€ к обсуждению целесообразности клонировани€ человека. ќднако это врем€, думаю, наступит не скоро, и в любом случае решение вопроса о клонировании того или иного человека будет регламентироватьс€ строгими рамками и правилами, каса€сь, возможно, только некоторых медицинских проблем, скажем непреодолимого другими методами бесплоди€.

¬ то же врем€, работы с домашними животными очень важны с практической точки зрени€.  лонирование ценных трансгенных животных может быстро и экономично обеспечить человечество новыми лекарственными препаратами, содержащимис€ в молоке, специально полученных дл€ этого генноинженерными методами овец, коз или коров.  лонирование высокопродуктивных домашних животных, в частности, молочных коров, может произвести буквально революцию в сельском хоз€йстве, так как только этим методом можно создать не отдельные экземпл€ры, а целые стада элитных коров рекордисток. Ёто же относитс€ к размножению выдающихс€ спортивных лошадей, ценных пушных зверей, сохранению редких и исчезающих животных в природных попул€ци€х и т.д.

Ќовые технологии, без сомнени€, принос€т пользу человечеству, и их необходимо вс€чески поощр€ть. «апреты нужны в тех крайних случа€х, когда €вно просматриваетс€ вред или ущерб дл€ здоровь€ и благополучи€ людей. ѕока клонирование человека можно отнести к этому разр€ду. Ќравственна€ сторона проблемы, тем не менее, уже стоит в полный рост. Ѕезудержно оптимистическую позицию, как мне представл€етс€, занимают только люди, плохо знающие вопрос. “ем, кто знает его, €сно: переносить еще не решенную методически научную разработку на человека безнравственно. ‘едераци€ научных обществ экспериментальных биологов —Ўј - а это более 52 тыс. членов - в окт€бре 1997 года объ€вила п€тилетний мораторий на эксперименты по клонированию человека. ¬едь они подразумевают участие множества конкретных людей, которые захот€т дать свои клетки, и суррогатных матерей, которые должны будут выносить плод. ј если так велико количество повреждений эмбрионов и мертворождений, если не€сен вообще конечный результат, этично ли даже говорить о переносе эксперимента на живых людей? Ѕолее того, найдутс€ безнравственные люди, которые под маркой помощи бесплодным парам, к примеру, начнут выманивать большие деньги, что скомпрометирует саму идею, научный поиск.

я вовсе не отрицаю того, что в будущем, когда проблема будет полностью решена методически, человечество признает клонирование как метод помощи бесплодным парам, стрем€щимс€ иметь родного им ребенка. ’от€ говорить, скорее, надо будет не о ребенке как таковом, а об одно€йцевом близнеце отца или матери, каким будет клонированный ребенок в биологическом смысле. Ќо тогда тем более потребуетс€ заранее решить этические и юридические вопросы, как это было дл€ трансплантации органов во многих странах мира. Ќормы биоэтики выдвигаютс€ сейчас на первый план. “е нравственные заповеди, которыми человечество пользуетс€ века, к сожалению, не предусматривают новых закономерностей и возможностей, какие вносит в жизнь наука. ѕоэтому люд€м и необходимо обсуждать и принимать новые законы общежити€, учитывающие новые реальности.

 лоны с изменЄнной ƒЌ .

Ќу вот и случилось то, чего так долго ждали и чего некоторые так бо€лись. ѕо€вилось сообщение, что ученым из уже знаменитой своей овцой ƒолли шотландской фирмы PPL Therapeutics (коммерческого отделени€ –озлин »нститута в Ёдинбурге) удалось получить успешные клоны овечек с измененной ƒЌ . Ўотландские ученые смогли осуществить клонирование, при котором генетический материал клона был "подправлен" с лучшую сторону.

Ќо прежде чем продолжать трубить в фанфары, немного истории.

≈сли помните, все началось с овечки ƒолли, котора€ была клонирована в 1996 году учеными из той же шотландской лаборатории, что и сегодн€шние овечки. “ермин "клонирование" означает выращивание из соматической, неполовой клетки точной генетической копии матери.  летка взрослой овцы сливалась с вз€той у другой овцы €йцеклеткой, из которой предварительно было удалено €дро, содержащее наследственную информацию. ÷итоплазма €йцеклетки и €дро взрослой клетки соедин€лись в своеобразное подобие оплодотворенной €йцеклетки. »з нее выращивалс€ эмбрион, который уже имплантировалс€ третьей овце. “о есть в случае с ƒолли был "обойден" половой процесс и св€занна€ с ним роль случа€ при комбинировании наследственных задатков. Ќапример, у ƒолли - бела€ морда финско-дорсетской породы (от генетической матери), хот€ она была выношена черномордой шотландской €ркой. ѕосле этого открыти€ начались многочисленные случаи "другого" клонировани€-копировани€. ћногие из них, при том же названии, тем не менее не повтор€ют эксперимента с ƒолли.

≈сть до сей поры несколько проблем, св€занных с ƒолли. ѕерва€, суд€ по всему, успешно разрешена. ќна заключалась в том, что ƒолли была не единственным клоном, полученным шотландскими учеными.  лонов было несколько дес€тков. ¬ живых осталась только одна ƒолли. Ќо за четыре года, прошедших с ее рождени€, суд€ по всему, ученым удалось настолько отточить технику клонировани€, что брак стал минимальным. ѕишу так осторожно, потому что не встречал конкретных цифр смертности различных клонов. Ёто пон€тно - кто же захочет расписывать собственные неудачи. ќднако, по косвенным данным, даже если брак и существует, то он не настолько велик, как в случае с ƒолли. (—уд€ по сообщени€м информационных агентств, в нынешнем эксперименте было имплантировано 80 эмбрионов, из них 14 родилось, три овцы дожили до шестимес€чного возраста. –езультат намного лучше, чем с ƒолли.)

¬тора€ проблема гораздо серьезней и масштабней, с научной точки зрени€. Ќесмотр€ на все победные фанфары в случае с ƒолли, до сих пор не€сным остаетс€ ее возраст и св€занные с ним проблемы. ƒело в том, что, возможно, возраст шестилетней матери настолько сильно "запечатлелс€" в ее клетках, что при рождении ƒолли ”∆≈ была немолодой особой. ѕоэтому так важна была очередна€ попытка ученых сотворить по методике копировани€ ƒолли кого-нибудь другого.

¬ случае работы доктора „икара  убота из Kogashima Cattle Breeding Development Institute и доктора ƒжерри янга из Animal Transgenic Facility университета  оннектикута это были клетки из ушной раковины 17-летнего призового быка, из которых получилось шесть тел€т. ¬ декабре 1997 года янг и  убота вз€ли образцы клеток и поместили их в питательную среду, причем было остановлено их деление. «атем с клетками была проделана така€ же операци€, что и с ƒолли. Ќо! ѕересадка €дра с генетической информацией была осуществлена не сразу, а спуст€ два мес€ца в одном случае и через три мес€ца в другом. „етыре теленка родились в декабре 1998 года, два - в феврале 1999 года. ѕричем, чем больше клетки "мариновались" в пробирке, тем стремительней было их развитие во чреве матери. “аким образом, ученым удалось показать, что возможен и не смертелен перерыв в "сборе" и "пересаживании" клеток к приемной матери.

Ётот эксперимент интересен и тем, что, как уже сейчас стало €сно, биологический возраст бычков из ушной раковины ћќЋќ∆≈, чем должен был быть и проблема с биологическим возрастом клона разрешена теоретически. ќсталось только подобрать ей надежное практическое решение.

¬от таким "поле битвы" научных открытий и идей было до недавнего времени. Ќа этом фоне шотландские ученые сделали еще один, революционный, шаг вперед. „то им удалось и что получилось?

Ќа последний вопрос ответить просто - три овцы, которые были рождены в прошлом году и до сих пор живы. ƒве ( упид и ƒиана) из них имеют ген, позвол€ющий им производить молоко с такими же белками, как и у человека. “реть€ не имеет измененного генома и просто €вл€етс€ контрольным экземпл€ром.

»з 80 эмбрионов, как € уже упоминал, выжило только три. ”ченые св€зывают такой отсев не с генетическими модификаци€ми овечек, а с теми же сложност€ми при клонировании.

„то удалось шотландским ученым и как?

¬ообще-то внедрение "чужеродных" генов в ƒЌ  животных - не редкость. Ќе редкость - даже внедрение их в половые клетки до оплодотворени€. Ќо это не позвол€ет нужным признакам сохранитьс€ в ребенке. ¬ противоположность этим работам, шотландским ученым удалось выработать методику внедрени€ чужеродных генов в клетку овцы до ее пересадки в €йцеклетку овцы-донора и последующего получени€ точной копии существа с нужными свойствами.

Ѕыл внедрен ген, который благополучно прошел множество проверок и теперь добавл€ет в молоко овец "лечебный" фермент, используемый в современной фармакологии дл€ лечени€ наследственной эмфиземии - болезни легких. “ак что, пейте люди молоко - дышите глубоко...

ƒиректор фирмы PPL Therapeutics јлан  олман утверждает, что "значение такой методики заключаетс€ в том, что мы теперь можем выбирать еще до рождени€ гены, которые хотим изменить или удалить".

„ем нам это свершение грозит?

”лучшенными свойствами клонов.

 лонами со свойствами, полезными дл€ человека.

¬озможностью выращивать дл€ пересадки человеческие органы внутри, например, свиней. ѕричем, по заданным параметрам и с меньшей веро€тностью отторжени€. ”ченые планируют получить генетически модифицированные клоны свиней уже в следующем году.

 лонированные порос€та.

¬ марте 2000 г., всЄ та же PPL Therapeutics объ€вила о том, что в их исследовательском центре родились п€ть клонированных порос€т.

 лонирование свиньи более сложна€ операци€, чем клонирование овец или коров, так как дл€ того, чтобы поддерживать одну беременность необходимо несколько здоровых плодов. ќрганы свиньи наиболее подход€т к человеку по размерам. —виньи легко размножаютс€ и известны своей неприхотливостью. Ќо самой большой проблемой остаетс€ отторжение органа животного, который человеческий организм не принимает за свой. »менно в этом направлении будут развиватьс€ дальнейшие исследовани€ ученых из –озлин »нститута. ”ченые вид€т один из возможных путей решени€ этой проблемы в том, чтобы генетически "замаскировать" органы животного, дл€ того, чтобы человеческий организм не мог распознать их как чужие. ¬нимание ученых сосредоточено на изучении гена под названием "alpha 1-3 gal transferase", который ответственен за отторжение чужеродных тканей иммунной системой человека.

≈ще одной темой дл€ исследовани€ €вл€етс€ попытка "очеловечить" генетическим путем органы свиньи, дл€ того чтобы значительно снизить риск отторжени€. ƒл€ этого предполагаетс€ вводить человеческие гены в хромосомы клонируемых свиней.

“ой же задачей, но без применени€ клонировани€, занимаютс€ и другие институты. Ќапример, компани€ "Imutran", расположенна€ в  ембридже, смогла получить целое стадо свиней, в генетическом наборе которых уже отсутствует одна из ключевых характеристик, ответственна€ за отторжение чужеродных тканей.  ак только будет получена пара мужской и женской особи, они будут готовы производить на свет "генетически чистое потомство", с органами, которые можно будет использовать дл€ трансплантации.

ƒа... совсем забыл сказать - клонировать человека пока никто не смог. » дело тут не в отличии его от овцы. ѕросто мало кто решитс€ экспериментировать с 80 эмбрионами человека, чтобы потом получить трех шестимес€чных младенцев. ѕроще выращивать нужные дл€ нас органы во чреве свиньи

 лонирование человеческих эмбрионов.

”же в сент€бре на родине овцы ƒолли может быть клонирован первый человеческий эмбрион. ѕравительство ¬еликобритании должно официально озвучить свою позицию по проблеме "терапевтического" клонировани€ человеческих существ. –ечь идет о создании ранних эмбрионов - своего рода банка донорских тканей дл€ конкретных индивидуумов.

—тволовые клетки (упрощенно - клетки ранних человеческих зародышей) давно наход€тс€ в центре внимани€ медицины из-за своих уникальных особенностей. ¬ этих клетках еще работают первобытно-мощные таинственные гены, которые навсегда "умолкают" в клетках взрослого человека. ѕотенциал роста стволовых клеток просто фантастический - достаточно вспомнить, что триллионноклеточный организм новорожденного человека образуетс€ из одной-единственной клетки всего лишь за 9 мес€цев! Ќо еще больше впечатл€ет потенциал дифференцировки - одна и та же стволова€ клетка может трансформироватьс€ в любую(!) клетку человека, будь то нейрон головного мозга, клетка печени или сердечный миоцит. "¬зрослым" клеткам така€ трансформаци€ не по силам.

≈ще одно свойство этих клеток превращает их в поистине бесценный объект дл€ медицины. "„ужие" стволовые клетки, введенные в организм человека, отторгаютс€ гораздо слабее, чем пересаженные целые органы, состо€щие из уже дифференцированных клеток. Ёто означает, что в принципе можно выращивать в лабораторных услови€х предшественники самых разных клеток (сердечных, нервных, печеночных, иммунных и др.), и затем трансплантировать их т€жело больным люд€м вместо донорских органов

—писок литературы

ƒл€ подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://learnbiology.narod.ru

Ёта тема прекрасно отражена в статье  онюхова Ѕориса ¬ладимировича - доктора биологических наук, заведующего лабораторией генетики развити€ »нститута общей генетики имени Ќ.». ¬авилова. «десь € просто приведу еЄ текст : ƒолли - случайность или

 

 

 

¬нимание! ѕредставленный –еферат находитс€ в открытом доступе в сети »нтернет, и уже неоднократно сдавалс€, возможно, даже в твоем учебном заведении.
—оветуем не рисковать. ”знай, сколько стоит абсолютно уникальный –еферат по твоей теме:

Ќовости образовани€ и науки

«аказать уникальную работу

—вои сданные студенческие работы

присылайте нам на e-mail

Client@Stud-Baza.ru