БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК.

                                                                 

                                                                      Реферат

студента 3 курса 6 группы

                                                       Ковальчука К.В.

Минск 2003г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение  ……………………………………………………………………………….3                                                                                                                           

Общий механизм репликации …………………………………………………………4                                                                                         

Основные ферменты репликации ……………………………………………………..5

                                                                  

Репликация у прокариот ……………………………………………………………….7                                                                                                  

Репликация у эукариот …………………………………………………………………9                                                                                                     

Заключение …………………………………………………………………………….. 11                                                                                                                       

Литература ………………………………………………………………………………11                                                                                                                         

Введение.

Вся информация о строении и функционировании любого организма содержится в закодированном виде в его ге­нетическом материале, основу которого у подавляющего числа организмов составляет ДНК.  Роль ДНК заключа­ется в хранении и пере­даче генети­ческой (наследственной) информации в живых организмах. Чтобы эта инфор­мация могла переда­ваться от одного поколения клеток (и организмов) к другому, необходимо её точное копиро­вание и после­дующее распределение её копий между потомками. Процесс, с помощью которого создаются копии молекулы ДНК, называется реплика­цией. Перед тем как раз­делится, клетки с помощью реп­ликации создают копию своего генома, и в результате клеточного деления  в каждую дочер­нюю клетку переходит одна копия. Бла­годаря этому, генетическая информация, содержащаяся в роди­тельской клетке, не исчезает, а сохраняется и пере­даётся потомкам. В случае многоклеточных организмов пе­редача этой информации осуществляется с помощью половых клеток, образующихся в результате мейотического деления и также несущих копию генома (гаплоидного). Их слияние приводит к объеди­нению двух родительских геномов в одной клетке (зиготе). Из неё развивается организм, клетки которого не­сут ге­нетическую информацию обоих родительских организмов. Таким образом, основное значение репликации за­ключается в снабжении потомства генетической информацией. Для обеспечения стабильности организма и вида ДНК должна реплицироваться полностью и с очень высокой точностью, что обеспечивается функционированием определённого набора белков. Замечательной особенностью ДНК является то, что она несёт гены кодирующие эти белки, и, таким образом, информация о механизме её собственного удвоения за­кодирована в ней самой.

Общий механизм репликации.

Точное самовоспроизведение ДНА  возможно благодаря её особой структуре. Модель структуры ДНК была об­народована Ф.Криком и Д.Уотсоном в 1953 году. Согласно ей  ДНК представляет собой длинную двухцепочечную полимерную молекулу. Мономерами  являются нуклеотиды, соединённые в каждой цепи фос­фодиэфирными связями. Сахарофосфатный остов молекулы, который состоит из фосфатных групп и дезоксири­бозных остатков соединён­ных 5'-3'-фосфодиэфирными связями , образует как бы боковины винтовой лестницы, а пары оснований -её ступеньки.  Две полинуклеотидные цепи навиты одна на одну, образуя двой­ную спираль. Вместе они удерживаются водородными связями , образующимися между комплиментарными основаниями про­тивоположных цепей (между А и Т; G и C). Цепи молекул ДНК антипараллельны: одна из них имеет направление 5¢®3¢, другая 3¢®5¢. Последовательность мономер­ных единиц (дезоксирибонуклеоти­дов) в одной её цепи соответствует (ком­пли­ментарна) последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой. Уот­сон и Крик предположили, что для удвое­ния ДНК должны произойти раз­рыв водородных связей и расхожде­ние це­пей(рис.1) и что удвоение ДНК происходит путём последовательного соедине­ния нуклеотидов на мат­рице материнской цепи в соответствии с правилом комплиментарности. В даль­нейшем эта матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными опытами. Подтверждение также получил пред­ложенный полуконсервативный способ репликации двухцепочечной ДНК {Мезельсон, Сталь, 1958 (объект-E.coli); Тэйлор,1958( объект-Vicia faba)}.Согласно ему, в результате дупликации образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской (консервативной), а вто­рая- заново син­тезированной.  Другие механизмы (консервативный, дисперс­ный) не под­твердились.

рис.1  . Рис.1 Модель репликации, предложенная Уотсоном и Криком. Комплиментарные цепи показаны разными цветами.

   зоны, где происходила репликация. Эта зона двига­лась вдоль роди­тельской двойной спирали. Из-за Y-образной структуры её назвали реплика­тивной вилкой. Именно в ней и происходят основные процессы, обеспечивающие синтез ДНК. Вилки образуются в структуре, называемой репликативный пузырёк. Это области хромосомы, где две нити родительской спи­рали ДНК разъединяются и служат как матрицы для синтеза ДНК. Это место, где происходит инициация реп­ликации, называется точкой начала реп­ликации (точкой ori). Образование репликативных вилок происходит в двух направлениях (двунаправленная репликация) и их они затем движутся до встречи с другой вилкой или с кон­цом матрицы. В некоторых слу­чаях наблюдается движение только одной вилки, тогда как вторая является ста­ционарной (однонаправленная репликация). У прокариот на нуклеоиде находится обычно только одна точка ori, тогда как у эукариот их много (например, у дрожжей порядка 500), рас­положенных на хромосоме на расстоянии 20-35 т.п.н. Участок между двумя точками ori получил название репли­кон. Скорость репликации у прокариот со­ставляет порядка 1000-2000 нуклеотидов в секунду, у эука­риот ниже из-за нуклеосомной органи­зации хроматина (10-200 нук­леотидов в секунду). Скорость репликации всей молекулы ДНК (или хромо­сомы) зависит от числа и распо­ложения точек ori.

Синтез ДНК в репликативной вилке проходит следующим образом. Цепи синтезируются в результате присоеди­нения 5¢-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксирибонуклеотидтрифосфатов к 3¢-гидроксильному концу уже имеющейся цепи (праймер, затравка). За один акт репликации праймерная цепь удлиняется на один нуклеотид, при этом одновременно удаляется один остаток пирофосфата. Цепи синтезируются в направ­лении 5¢®3¢ вдоль мат­ричной цепи, ориентированной в противоположном, 3¢®5¢, направлении. Синтез Цепей в обратном направлении не происходит никогда, поэтому синтезируемые цепи в каждой репликативной вилке должны расти в противоположных направлениях. Синтез одной цепи(ведущей, лидирующей) происходит непрерывно, а другой (отстающей) импульсами. Такой механизм репликации называется полунепрерывным. Ведущая цепь растёт от 5¢- к 3¢-концу в направлении движения репликативной вилки и нуждается только в одном акте ини­циации. Рост от­стающей цепи также идёт от 5¢- к 3¢-концу, но в направлении противоположном движению реп­ликативной вилки. Для синтеза отстающей цепи должно произойти несколько актов ини­циации, в результате чего образуется множе­ство коротких цепей, называемых фрагменты Оказаки в честь от­крывшего их учёного - Р.Оказаки. Размеры их: 1000-2000 нуклеотидов у прокариот, 100-200 нуклеотидов у эукариот. По мере дви­жения репликативной вилки концы соседних фрагментов Оказаки соединяются с обра­зованием непрерывной отстающей цепи. Механизмы инициации репликации в точке ori и при образовании фрагментов Оказаки в принципе аналогичны. В обоих слу­чаях происходит образование РНК- затравок (дли­ной 10-12 нуклеотидов), комплиментарных матричной ДНК, в виде продолжения которых синтезируется но­вая цепь ДНК. В дальней­шем короткие вставки РНК  замещаются сегментами ДНК, которые затем объединя­ются с образованием не­прерывных цепей.

Основные ферменты репликации.

Репликация является ферментативным процессом, а не спонтанным как сначала предполагали Уотсон и Крик. В ре­пликации участвуют следующие основные группы ферментов.

ДНК-полимеразы. Ферменты, которые узнают нуклеотид материнской цепи, связывают комплиментарный нук­леозидтрифосфат и присоединяют его к 3¢-концу растущей цепи 5¢-концом. В результате образу­ется 5¢-3¢-диэфирная связь, высвобождается пирофосфат и растущая цепь удлиняется на один нуклеотид. Та­ким об­разом, ДНК-поли­мераза движется от 3¢- к 5¢-концу молекулы материнской ДНК, синтезируя новую цепь. ДНК-полимеразе для ра­боты нужен праймер (т.е. 3¢-ОН группа для присоединения нового нуклеотида) и матрица, детерминирующая при­соединение нужного нуклеотида. ДНК-полимеразы помимо полимеразной активности, имеют экзонуклеазную активность, они способны к гидролизу фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на не спаренном конце ду­плексной ДНК. За  один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3¢-конца цепи (3¢-5¢-экзонуклеаза) или с 5¢-конца цепи дуплексной ДНК (5¢-3¢-экзонуклеаза). Эти различные ак­тивности присущи разным сайтам полипептидной цепи ДНК-полимераз. 3¢-5¢-экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклео­тида и удаление ошибочных нуклеотидов с расту­щего конца цепи. Все ДНК-полимеразы способы осуществлять данный тип реакции. Многие(но не все) ДНК-полимеразы обладают также 5¢-3¢-экзонуклеазной активностью. При сочетании 5¢-3¢-экзонуклеазной и поли­меразной актив­ностей происходит последовательное отщепление нуклеоти­дов с 5¢-конца одноцепочечного разрыва в дуп­лексе и удлинение цепи с 3¢-конца. В результате место разрыва пе­ремещается по цепи в направ­лении от 5¢- к 3¢- концу(так называемая ник-трансляция).

ДНК-лигазы --ферменты, осуществляющие соединение цепей ДНК, т.е. катализирующие образование фосфоди­эфирных связей между 5¢-фосфорильной и 3¢-гидроксильной группами соседних нуклеотидов в местах разрывов ДНК.  Для образования новых фосфодиэфирных связей требуется энергия в форме АТФ либо НАД.

ДНК-геликазы (ДНК-хеликазы)—ферменты, осуществляющие расплетание двойной спирали ДНК. Для разделения цепей ис­пользуется энергия АТФ. Геликазы часто функционируют в со­ставе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию расплетённых цепей. Для расплетания дос­та­точно одного геликазного белка, но для  того. Чтобы максимизи­ровать скорость раскручивания. Несколько геликаз могут дейст­вовать совместно.

Рис.2 Геликазная активность белка DnaB E.coli[3].

ДНК-топоизомеразы—ферменты, изменяющие степень сверхспиральности и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс ДНК, находящейся перед вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цепей в репликативной вилке, что явля­ется необходимым условием для её непре­рыв­ного движения. Кроме того, топоизомеразы (типа II) обеспечивают разделение или образование катена­нов - сцеплен­ных кольцевых ДНК (образу­ются в результате репликации кольцевой ДНК), а также устране­ние узлов и спутанных клубков из длинной линейной ДНК. Су­ществует два типа топоизомераз. Топоизомеразы типа I уменьшают число сверхвитков в ДНК на единицу за один акт. Эти топоизомеразы надрезают одну из двух цепей, в результате чего фланкирующие дуплексные области могут повернутся вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Эта реакция не      требует энергии АТФ, т.к. энергия фосфодиэфирной связи сохраняется благодаря тому, что тирозиновый остаток в моле­куле фер­мента выступает то в роли акцеп­тора, то в роли до­нора фосфорильного конца разрезанной цепи.

Рис.3 Действие топоизомеразы I (Topo I). [3.]

       Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплиментарные цепи, пропускают двухцепо­чечный сегмент той же самой или другой молекулы ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. В резуль­тате за один акт снимаются два по­ложительных или от­рицательных сверхвитка. Топои­зомеразы типа II тоже ис­пользуют тирозиновые ос­татки для связывания 5¢-конца каждой разорванной цепи в то время . когда другой дуп­лекс проходит че­рез место разрыва.

              Праймаза—фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи.

Рис.4 Действие топоизомеразы II: (a) образование отрицательных сверхвитков, (b) разделение и образование катенанов[3].

Репликация у прокариот.

Escherichia coli. У этой бактерии (как и ещё некоторых исследованных видов) в области точки инициации репликации (ori C, длиной примерно 245 п.н.) находятся повторы размером в 13 и 9 пар оснований (Рис.5). При инициации 10-20 молекул белка инициации реплика­ции Dna A связывается с четырьмя девятимерными  повторами (9-mers) и расплетает ДНК в районе тандем­ного набора тринадцатимеров, богатых АТ парами (что облегчает их расплетание, т.к. между А и Т только две водородные связи). Белок Dna C доставляет шестисубъединичный белок Dna B (геликаза) к матрице. На каж­дую из одиночных цепей садится по одному Dna B  и они затем двигаются в разных направлениях расплетая ДНК.

Рис.5 Модель инициации репликации в ori C E.coli.[3].

  Две ДНК-полимеразы  с помощью своих двух b-субъединиц прикрепляются к нити ДНК и начинают синтез ДНК. Расплетанию спирали способст­вует  SSB-белки, которые связываются с одноцепочечными участками ДНК, предотвращают образование шпи­лек и тем са­мым стабилизируют расплетённый дуплекс. Сбалансированное действие топоизомеразы II (гираза), способной индуцировать отрицательные сверхвитки(см.рис.4), и топоизомеразы I, снимающей отрицательные сверх­витки(см.рис.3) регулирует степень сверхспиральности ДНК и таким образом влияет на скорость движе­ния реп­ликативной вилки. 

У прокариот обнаружено три типа ДНК-полимераз. Их свойства приведены ниже.

Свойство / тип полимеразы	I	II	III
полимеризация: 5¢-3¢	+	+	+
экзонуклеазная активность:
5¢--3¢	+	+	+
3¢--5¢	+	--	--
синтез на:
ДНК без праймера	--	--	--
одноцепочечная ДНК с праймером	+	--	--
одноцепочечная ДНК с праймером и SSB-белками	+	--	+
скорость синтеза (нуклеотиды в минуту)	600	?	30000
Табл.1 Свойства ДНК-полимераз E.coli [3]. количество молекул в клетке	400	?	10--20

III  осуществляет удлинение лидирующей цепи, а также удлинение РНК-праймеров с обра­зова­нием фрагментов Оказаки длиной от 1000 до 2000 нуклеотидов. Две ДНК-полимеразы связаны между со­бой t-субъединицей. Удаление сегментов РНК с 5¢-конца каждого фрагмента Оказаки и заполнение пробелов между ними катализируетcя ДНК-полимеразой I ,способной удлинять цепь и осуществлять ник-трансляцию. Когда рас­тущий 3¢-гидро­ксильный конец каждого фрагмента Оказаки до­ходит до 5¢ –дезоксинуклеотид­ного конца соседнего фраг­мента, вступает в действие ДНК- лигаза и образуется непре­рыв­ная отстающая цепь. Роль ДНК-полимеразы II в репликации не выяснена.

   Обнаружен специальный белок терминации – Tus-белок. Он задерживает геликазу, в результате  чего прекращается расплетение нити и происходит терминация репликации.

   

Рис.6 Синтез ДНК в репликативной вилке.[2]

                                                                                                                                      

Репликация у эукариот.

Как и в случае с E.coli исследования  репликации в эукариотических клетках сначала были сосредото­чены на характеристике различных ДНК-полимераз (см. табл.2).

свойство / тип полимеразы	a	b†	d	g	e
полимеризация: 5¢-3¢	+	+	+	+	+
экзонуклеазная активность: ‡3¢-5¢	--	--	+	+	+
синтез от:
ДНК-праймера	+	+	+	+	+
РНК-праймера	+	--	--	+	?
связь с ДНК-праймазой	+	--	--	--	--
расположение в клетке:
ядро	+	+	--	+	+
митохондрии	--	--	+	--	--

                  

                    Табл.2 Свойства ДНК-полимераз клеток млекопитающих *.                        

                        *  ДНК-полимеразы дрожжей аналогичны полимеразам a, b ,g  соответственно

     ^{†    ДНК-полимераза наиболее активна на молекулах ДНК с брешами около 20               нуклеотидов и  предположительно  участвует в репарации ДНК}                         

                                      ^{‡   FEN1-} эукариотическая 5¢-3¢ экзонуклеаза, удаляющая РНК-праймеры; по своей

структуре и функциям она схожа с доменом ДНК-полимеразы I E.coli имеющего 5¢-3¢                         экзонуклеазную активность.[3].

 

Следующим этапом стало создание систем для репликации хромосом вирусов животных in vitro. В ре­зуль­тате в настоящее время хромосома вируса SV40 может быть реплицирована in vitro с использованием всего лишь восьми компонентов клеток млекопитающих. По своим свойствам эти белки напоминают белки необхо­димые для репликации в E.coli. Репликация ДНК эукариот также идёт в двух направлениях; для син­теза ДНК нужны праймеры синтезируемые праймазой; синтез лидирующей цепи непрерывен, а отстающей прерывистый. Как показано на рис.7, инициация репликации ДНК вируса SV40 происходит в уникальном сайте, точке начала репликации, путём связывания кодируемого вирусом белка, называемого T antigen, или T_ag.

Этот полифункциональный белок расплетает дуплекс ДНК благодаря своей геликазной активности. Распле­тание дуплекса требует также наличия АТФ и белка репликации A (RPA), кодируемого клеткой-хозяи­ном и обладающего способностью связываться с однонитчатой ДНК (как SSB-белки в E.coli). Одна молекула ДНК-полимеразы α (Pol α) прочно связывается с праймазой и затем связывается с образовавшейся однонит­чатой ДНК. Праймаза образует РНК-праймеры, которые затем удлиняются на небольшую длину Pol α , обра­зуя пер­вую часть ведущих цепей, которые растут от точки ori в противоположных направлениях. Активность Pol α стимулируется фактором репликации C (RFC).

Затем  c 3-концамb удлинённых Pol α РНК-праймеров связывается PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и замещает Pol α на обоих растущих ведущих цепях, прерывая их синтез. На следующем этапе Pol δ связывается с PCNA на 3¢-концах растущих цепей. PCNA повышает процессивность Pol δ так, что полимераза может непрерывно продолжать синтез ведущих цепей. Таким образом, функция PCNA аналогична функции β-субъединицы полимеразы III E.coli, т.к. оба белка образуют сходные структуры (“кольца”), охватывающие ДНК и способствующие удержанию полимераз на цепи ДНК. Они, однако, имеют различные первичные структуры; кроме того PCNA-тример, а не димер как β-субъединица полимеразы III E.coli.

Комплекс праймаза- Pol α. садится на цепь, являющуюся матрицей для отстающей цепи и вместе с RFC осуще­ствляют синтез запаздывающей цепи.

Наконец, как и в E.coli топоизомеразы сни­мают меха­ническое напряжение, возникающее при распле­тании ДНК в репликативной вилке, и участ­вуют в разделе­нии двух дочерних хромосом. Од­нако топои­зомеразы эукариот имеют некоторые от­личия от прокариотиче­ских: 1.топоизомеразы I эукариот взаи­модействуют с 3¢-фосфорильным концом разорванной цепи (прока­риотические --с 5¢-фосфорильным кон­цом) 2. топои­зомеразы I эукариот устраняют как отри­цательные, так и положительные сверх витки (прокариотиче­ские—только отрицательные) 3.топоизомеразы II эу­кариот не способны инду­циро­вать образование отрица­тельных сверхвит­ков (как это делает в релаксирован­ных кольцевых ДНК гираза бактерий).

Итак, получено много данных об эукариотических белках, осуществляющих репликацию ДНК вируса SV40 in vitro. Как упоминалось ранее, инициация репликации ДНК SV40 in vitro требует наличие вирусного белка - T антигена. Для инициации же репликации у эукариот хромосомной ДНК  необходим целый комплекс белков. Так, у дрожжей с сайтом ori в течение всего жизненного цикла связан комплекс из 6 разных белков (ORC), к которому в интерфазе присоединяется ещё целый ряд белков и образованный комплекс инициирует процесс репликации. Такие же белки синтезируются всеми эукариотическими клетками.

Рис.7 Модель репликации ДНК вируса SV40 in vitro с помощью эукариотических ферментов.[3.]

Хромосомы эукариот линейны и их концы представлены теломерами, со­стоящими из повто­ряющихся олигомерных последо­вательностей; у человека это 25-200 копий последовательности TTAGGG. Наличие специ­альной области на концах эукариотических хро­мосом абсолютно необходимо. Дело в том, что при удалении последнего РНК-праймера отстаю­щей цепи, на 5-конце этой цепи остаётся брешь, которую не способна заполнить ни одна из ДНК-полимераз, т.к. всем им для работы необходим праймер со свободным 3-ОН концом. Без сущест­вования какого-либо специального меха­низма дочерняя нить ДНК, синтезируемая на от­стающей цепи, укорачивалась бы с каждым клеточным де­лением. Ферментом, предотвращаю­щим такое укорочение, является теломераза. Этот фермент имеет ассоциированную с ним короткую нить РНК, комплиментарную шестичленной после­до­вательности, повторяющейся в теломере и слу­жащую матрицей для синтеза ДНК теломеров. Бла­годаря этому механизму эукариотические хромо­сомы могут реплицироваться полностью. Репликация в большинство соматических клеток проходит без участия теломеразы, поэтому с каж­дым делением длина хромосом клетки укорачи­ва­ется и после определённого числа делений хромо­сомы утрачивают теломеры и начинают терять смысловые участки , что приводит к гибели клетки.  Теломераза активна в половых, раковых клетках и клетках одноклеточных эукариот.

       

Заключение.

Нужно отметить, что существует ряд объектов, репликация которых проходит по несколько иному ме­ханизму, чем было описано выше. Так, например, кольцевая ДНК митохондрий и хлоропластов реплицируется с образованием D-петель (сначала начинает реплицироваться одна цепь, в результате чего об­разуется структура в форме D, а после репликации более половины первой нити, начинает синтезироваться вторая); ряд плазмид и ДНК некоторых вирусов реплицируется по типу катящегося кольца и т.п. Однако принципиальная схема репликации для всех биологических объектов остаётся одной и той же.

Литература.

1.            Гены и геномы.  М.Сингер, П.Берг.   – М.: Мир, 1998. –376 с.

2.            Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. 
Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Watson, James D.
New York and London: Garland Publishing; c1994

3.            Molecular Cell Biology. 4th ed.
Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E.
New York: W H Freeman & Co; c2000.

 

           

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Биологический факультет РЕПЛИКАЦИЯ ДНК.                                                                                                     

 

• 14:21 05 Июля 2016
  Российско-китайский медуниверситет откроет магистерскую программу по TCM
• 01:21 05 Июля 2016
  На форуме МГУ Россия и Китай обсудят научно-образовательное сотрудничество
• 11:00 04 Июля 2016
  Реморенко: "ЕГЭ-туризм" в России сходит на нет
• 10:52 04 Июля 2016
  Летняя российско-австрийская школа откроется в Москве
• 15:31 01 Июля 2016
  В СПбГУ могут воссоздать географический факультет

Заказать уникальную работу